ATG7 et ATG14 limitent la réplication cytosolique et phagosomale de Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages humains

Nature Microbiology volume 8, pages 803–818 (2023)Citer cet article

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L'autophagie est un mécanisme cellulaire de défense immunitaire innée contre les micro-organismes intracellulaires, dont Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La manière dont l'autophagie canonique et non canonique fonctionne pour contrôler l'infection à Mtb dans les phagosomes et le cytosol reste non résolue. Les macrophages sont la principale cellule hôte chez l'homme pour Mtb. Ici, nous avons étudié les contributions de l'autophagie canonique et non canonique dans les macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites génétiquement (iPSDM), en utilisant un ensemble de mutants Mtb générés dans le même contexte génétique que la souche de laboratoire commune H37Rv. Nous avons surveillé la réplication de mutants Mtb qui sont soit incapables de déclencher l'autophagie canonique (Mtb ΔesxBA), soit apparemment incapables de bloquer l'autophagie non canonique (Mtb ΔcpsA) dans iPSDM dépourvu d'ATG7 ou d'ATG14 à l'aide d'une imagerie unicellulaire à haut contenu. Nous rapportons que la suppression d'ATG7 par CRISPR – Cas9 dans iPSDM a entraîné une réplication accrue de Mtb de type sauvage mais pas de Mtb ΔesxBA ou Mtb ΔcpsA. Nous montrons que la suppression d'ATG14 a entraîné une réplication accrue à la fois du type sauvage Mtb et du mutant Mtb ΔesxBA. À l'aide de reporters Mtb et d'imagerie quantitative, nous avons identifié un rôle pour ATG14 dans la régulation de la fusion des phagosomes contenant Mtb avec des lysosomes, permettant ainsi la restriction des bactéries intracellulaires. Nous concluons que ATG7 et ATG14 sont tous deux nécessaires pour restreindre la réplication de Mtb dans les macrophages humains.

Deux principales voies d'autophagie ont été impliquées dans la défense de l'hôte contre les agents pathogènes intracellulaires : la voie canonique de la xénophagie1,2,3 et une voie non canonique appelée phagocytose associée à LC3 (LAP)4,5. La xénophagie est une forme spécialisée de macroautophagie dans laquelle la biogenèse de l'autophagosome de novo capture les bactéries dans des autophagosomes à double membrane qui ciblent les lysosomes6. La rupture des bactéries contenant des phagosomes déclenche l'exposition des fractions glucidiques luminales au cytosol qui sont reconnues par les galectines pour initier la xénophagie7,8. La xénophagie peut également être initiée par l'ubiquitination des protéines de l'hôte et de l'agent pathogène et du lipopolysaccharide lors de lésions membranaires ainsi que suite à la fuite de bactéries dans le cytosol9,10. Dans le LAP, les membres de la famille Atg8 des protéines d'autophagie sont conjugués directement à des membranes phagosomales uniques pour permettre la maturation du phagosome4. Il a été démontré que le ciblage des agents pathogènes sur le LAP a des résultats différents ; dans certains cas elle est restrictive, mais dans d'autres elle favorise la réplication bactérienne5. Mécaniquement, LAP nécessite la machinerie de lipidation LC3 de Atg7, Atg3 et Atg5-12-16L1, ainsi que le complexe PI3K (Beclin1, UVRAG, Rubicon, Vps34 et Atg101) et la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par la NADPH oxydase . Le LAP ne nécessite pas les composants du complexe ULK1 ni Atg14, qui sont tous deux essentiels à la xénophagie11. Malgré les progrès récents, la régulation spatiale et temporelle entre les réponses autophagiques canoniques (xénophagie) et non canoniques (LAP) lors d'une infection par des pathogènes intracellulaires reste mal caractérisée chez les macrophages humains.

Il existe des preuves que la xénophagie et le LAP jouent un rôle dans la réponse des macrophages de l'hôte à l'infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb)2,12. D'autre part, Mtb délivre plusieurs effecteurs bactériens dans les cellules hôtes qui interfèrent avec l'autophagie13. De plus, Mtb endommage la membrane phagosomale et pénètre dans le cytosol de l'hôte par l'action coordonnée du système de sécrétion ESX-1 de type 7 (T7SS) codé dans la région de différence 1 (RD1) 14,15,16 et les lipides de la paroi cellulaire phthiocérol dimycocérosates (PDIM)17,18,19,20. Le ciblage de Mtb vers l'autophagie et l'évasion par Mtb est hautement dynamique et temporellement régulé13,21. Les dommages induits par Mtb à la membrane phagosomale induisent des structures autophagosomales tubulovésiculaires complexes (LC3-TVS)22. Suite à l'induction de LC3-TVS, Mtb se sépare des membranes autophagosomales, évitant la xénophagie et s'échappant dans le cytosol22. La sous-population phagosomale restante de Mtb manipule activement la voie de maturation du phagosome13. Cependant, pour une sous-population de bactéries qui accèdent au cytosol, le ciblage vers la xénophagie est probablement réussi et conduit à leur restriction. Le LAP ne contribue pas à la restriction de Mtb de type sauvage (WT) dans les macrophages de souris car Mtb subvertit cette voie par la sécrétion de CpsA. CpsA bloque l'action de la NADPH oxydase et réduit ainsi l'activation des ROS et des LAP phagosomiques12.

Dans les macrophages de souris, la perturbation de la voie de l'autophagie par knock-out (KO) des gènes clés de l'autophagie sélective augmente la réplication de Mtb12,23,24,25. Cependant, le KO conditionnel in vivo de plusieurs protéines d'autophagie murine n'a modifié ni les charges bactériennes de Mtb ni la survie des souris après l'infection26. Bien qu'il soit clair que Mtb peut être efficacement restreint par les réponses d'autophagie in vitro, ces résultats in vivo ont conduit à postuler que l'autophagie n'est pas importante pour le contrôle de Mtb dans le modèle de souris tuberculeuse (TB)27, potentiellement en raison d'une subversion efficace in vivo ; ainsi, le rôle de l'autophagie dans la tuberculose reste incertain.

En raison d'un manque de systèmes génétiques robustes, il n'a pas été possible auparavant d'utiliser des approches spécifiques de suppression de gènes pour étudier le rôle de l'autophagie dans les macrophages humains primaires. De telles approches pourraient améliorer notre compréhension de l'autophagie dans l'infection, car les knockdowns, ou stratégies KO conditionnelles, peuvent entraîner une élimination incomplète de tous les processus d'autophagie dans les cellules hôtes. Dans cet article, pour mieux comprendre le rôle de l'autophagie dans la destruction de Mtb chez l'homme, nous avons développé un modèle de cellule macrophage humaine et étudié les rôles de ATG7 et ATG14 dans la réplication bactérienne et la mort cellulaire.

Pour étudier le rôle de la réponse de l'autophagie à l'infection par Mtb dans les macrophages humains et pour réduire les incohérences associées aux modifications du fond génétique de la souche parentale, nous avons généré deux mutants de suppression de gène et des souches complémentaires apparentées dans le fond Mtb H37Rv. Tout d'abord, nous avons généré une souche dépourvue à la fois d'EsxA et d'EsxB (Mtb ΔesxBA), deux substrats de l'ESX-1 T7SS responsables des dommages au phagosome et de l'induction de la xénophagie (Fig. 1a) 28,29. La délétion d'esxBA a été confirmée en sondant les protéines EsxA et EsxB dans le lysat de cellules entières et le filtrat de culture par western blot (Fig. 1b). Comme prévu, ni EsxA ni EsxB n'ont été détectés dans le filtrat de culture ou le lysat de cellules entières de Mtb ΔesxBA ou Mtb ΔRD1, qui a été utilisé comme contrôle. Le mutant Mtb ΔesxBA a été complété en plaçant à la fois l'expression de Mtb H37Rv esxB et esxA sous le contrôle du puissant promoteur Psmyc30 au site MS6 du chromosome. L'expression et la sécrétion des protéines EsxA et EsxB complémentées ont été validées par western blot (Fig. 1b). Ensuite, nous avons généré une deuxième souche mutante dépourvue de CpsA (Mtb ΔcpsA), qui serait incapable de bloquer le LAP dans les macrophages12 (Fig. 1c). Le mutant Mtb ΔcpsA a été complémenté par intégration chromosomique du gène cpsA placé sous le contrôle du promoteur fort hsp60 au site MS6. La production et la sécrétion d'EsxA et d'EsxB n'ont pas été affectées dans Mtb ΔcpsA et Mtb ΔcpsA: cpsA (Fig. 1d). Il est important de noter que les profils de réplication in vitro (Fig. 1e, f) et la production de PDIM de ces souches étaient similaires dans les milieux liquides 7H9, ce qui indique que la réplication extracellulaire n'était pas affectée (Fig. 1g). Toutes les souches recombinantes générées ont ensuite été transformées avec des vecteurs codant pour la protéine fluorescente E2-Crimson et leurs profils de réplication dans iPSDM ont ensuite été analysés par imagerie à haut contenu et analyse unicellulaire. L'absorption de Mtb par les macrophages n'a pas été affectée par les délétions esxA / esxB ou cpsA (Fig. 1h). Cependant, la réplication de Mtb ΔesxBA a été réduite dans iPSDM après 96 h d'infection (Fig. 1i, j). Une réduction similaire a été observée après infection d'iPSDM avec le mutant Mtb ΔcpsA (Fig. 1k, l). La complémentation de Mtb ΔesxBA et Mtb ΔcpsA avec des gènes esxBA ou cpsA fonctionnels a restauré leur capacité à se répliquer dans les macrophages (Fig. 1i – l).

a, c, Mtb esxBA-rv3874-75 locus (a) et cpsA-rv3484 locus (c) dans Mtb WT et les souches de suppression respectives. Les demi-flèches noires représentent les positions des amorces (CmR, résistance au chloramphénicol ; ZeoR, résistance à la zéocine ; Prom., promoteur groEL). b,d, Western blot d'EsxA et EsxB à partir de lysats cellulaires totaux et de filtrats de culture de Mtb WT, ΔRD1, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (n = 3) (b) ou Mtb WT, ΔcpsA et ΔcpsA:souches cpsA (n = 1 ) (d). Ag85 a été utilisé comme témoin de chargement. e, Courbes de croissance de Mtb WT, ΔesxBA et ΔesxBA:BA. f, Courbes de croissance des souches Mtb WT, ΔcpsA et ΔcpsA:cpsA. g, Analyse par chromatographie en couche mince de PDIM à partir de cultures Mtb WT, ΔcpsA, ΔcpsA:cpsA, ΔesxBA et ΔesxBA:BA (n = 1). Du PDIM purifié et des extraits de Mtb ΔPDIM ont été utilisés comme témoins. h, Analyse quantitative de la zone Mtb WT, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (en haut) et Mtb WT, ΔcpsA, ΔcpsA:cpsA (en bas) par cellule unique, 2 h après l'infection. Données représentatives de trois expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (sem). L'ANOVA à un facteur a suivi avec le test de comparaison multiple de Šídák. NS, non significatif. i, Instantané d'iPSDM vivant infecté par Mtb WT, ΔesxBA et ΔesxBA:BA 96 h après l'infection. Coloration nucléaire (bleu) et Mtb-E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 50 µm. j, Analyse quantitative de la réplication de Mtb après infection par Mtb WT, ΔesxBA et ΔesxBA:BA. La surface de Mtb par cellule a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à 2 h après l'infection. Données représentatives de trois expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA à une voie suivie du test de comparaison multiple de Šídák. ***P < 0,001 ; NS, non significatif. k, Images représentatives d'iPSDM fixe infecté par Mtb WT, ΔcpsA et ΔcpsA:cpsA 96 h après l'infection. Coloration nucléaire (bleu) et Mtb-E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 50 µm. l, Analyse quantitative de la réplication de Mtb après infection par Mtb WT, ΔcpsA et ΔcpsA:cpsA. La surface de Mtb par cellule a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à 2 h après l'infection. Données représentatives de trois expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA à une voie suivie du test de comparaisons multiples de Šídák **P < 0,002 ; NS, non significatif.

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Ensuite, nous avons utilisé des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) - Cas9 pour éliminer ATG7 ou ATG14 dans des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) afin d'étudier les réponses d'autophagie canoniques et non canoniques à Mtb (Extended Data Fig. 1a, d) . Nous avons testé si les réponses d'autophagie étaient altérées dans les iPSC ATG7 et ATG14 KO (appelées ATG7-/- et ATG14-/-). Le WT iPSC (appelé ATG7+/+ et ATG14+/+) a accumulé LC3B-II en réponse à l'induction de l'autophagie canonique par la famine, au blocage de la dégradation de l'autophagosome par la bafilomycine A1 (BafA1) ou à l'induction de l'autophagie non canonique par le traitement au monensin31, alors qu'ATG7 KO iPSC avait des niveaux indétectables de LC3B-II (Extended Data Fig. 1b, e). De plus, ATG7 KO iPSC a montré une accumulation de p62 dans toutes les conditions par rapport à WT iPSC (Extended Data Fig. 1b). Comme prévu, ATG14 KO iPSC a montré des niveaux accrus de p62 par rapport à WT iPSC, même dans des conditions nourries, et n'a pas réussi à modifier les niveaux de LC3B-II en réponse à la famine ou à BafA1 (Extended Data Fig. 1e). En revanche, le traitement au monensin a entraîné une augmentation des niveaux de LC3B-II et des niveaux indétectables de LC3B-I dans les iPSC WT et ATG14 KO (données étendues Fig. 1e). Nous avons ensuite testé si la différenciation en iPSDM affectait les phénotypes d'autophagie des iPSC ATG7 KO et ATG14 KO. Comme prévu, ATG7 KO iPSDM a montré un traitement LC3B défectueux et une augmentation des niveaux de p62 dans des conditions de repos (Extended Data Fig. 1c). Fonctionnellement, l'ATG14 KO iPSDM n'a montré aucun changement substantiel dans le traitement LC3B après la famine ou le traitement BafA1 (Extended Data Fig. 1f). L'induction de l'autophagie non canonique avec la monensine a augmenté le traitement de LC3B dans WT et ATG14 KO iPSDM, et les niveaux de p62 sont restés largement inchangés dans toutes les conditions testées (Extended Data Fig. 1f). Ensuite, les clones iPSDM ont été caractérisés par cytométrie en flux pour l'expression de surface des marqueurs macrophages. Après la différenciation induite par le M-CSF, tous les iPSDM ont montré une réduction de CD14 et une augmentation des niveaux d'expression de surface de CD11b, comme indiqué précédemment22,32 (Extended Data Fig. 2). Lors de la différenciation, l'expression de surface ATG7 et ATG14 KO iPSDM de CD163 et CD206 était similaire à WT iPSDM alors que les niveaux de CD169 étaient plus élevés dans ATG7 et ATG14 KO iPSDM (Extended Data Fig. 2).

Nous avons ensuite infecté ATG7 KO iPSDM avec Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA exprimant E2-Crimson et analysé la réplication bactérienne par imagerie unicellulaire à haut contenu. Le signal de Mtb par macrophage a augmenté d'environ trois fois dans ATG7 KO iPSDM contre deux fois par rapport à WT iPSDM après 96 h d'infection (Fig. 2a, b). Ces différences n'étaient pas dues à une modification de l'absorption ou de la diffusion bactérienne dans ATG7 KO iPSDM, car la surface bactérienne par cellule lors de l'absorption et le pourcentage de cellules infectées à tous les moments étaient similaires dans les deux contextes génétiques (données étendues Fig. 3a, b). L'augmentation de la réplication bactérienne n'a été observée que pendant l'infection par Mtb WT puisque les mutants Mtb ΔesxBA et ΔcpsA étaient restreints dans l'ATG7 KO iPSDM (Fig. 2c – f). Comme prévu, après infection d'ATG7 KO iPSDM avec Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA, il n'y a pas eu d'induction du traitement LC3B (Extended Data Fig. 3c). Les niveaux de p62 dans ATG7 KO iPSDM étaient plus élevés pour Mtb WT et ΔcpsA par rapport à WT iPSDM, potentiellement en raison d'une régulation positive de la transcription (Extended Data Fig. 3c). La restriction de Mtb ΔcpsA dans iPSDM n'était pas associée à la localisation de la NADPH oxydase car aucune différence dans le recrutement de p40 Phox vers Mtb WT et ΔcpsA n'a été observée après 2 h d'infection (Extended Data Fig. 4). Cependant, 48 h après l'infection, les niveaux d'association de p40 Phox avec Mtb ΔcpsA étaient plus élevés que ceux de Mtb WT dans l'iPSDM infecté. Au cours de l'analyse, nous avons remarqué que dans l'ATG7 KO iPSDM infecté par Mtb WT, il y avait une réduction du nombre total de cellules analysées par imagerie à haut contenu suggérant la mort cellulaire, un processus associé à la réplication de Mtb dans les macrophages dérivés de monocytes humains (MDM )14. Pour tester cela, nous avons coloré les cellules infectées avec NucGreen qui colore sélectivement les cellules dont l'intégrité de la membrane plasmique est compromise33. Le pourcentage de cellules mortes dans ATG7 KO iPSDM était significativement plus élevé après infection par Mtb WT, ce qui indique que, dans les cellules ATG7 KO, l'infection était associée à la mort des cellules macrophages (Fig. 2g, h).

a,c,e, Instantané d'ATG7+/+ et ATG7−/− iPSDM vivants infectés par Mtb WT (a), ΔesxBA (c) et ΔcpsA (e) à 96 h. Coloration nucléaire (bleu) et Mtb-E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 50 µm. b, d, f, Analyse quantitative à haut contenu de la réplication de Mtb après infection de ATG7+/+ ou ATG7−/− iPSDM avec Mtb WT (b), ΔesxBA (d) et ΔcpsA (f). La surface de Mtb par cellule a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à 2 h après l'infection. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem. Un test t bilatéral non apparié a été utilisé pour les comparaisons ** P < 0,002 ; NS, non significatif. g, Images représentatives d'ATG7+/+ et d'ATG7−/− iPSDM non infectés (CTRL) ou infectés par Mtb WT pendant 96 h. Coloration nucléaire (bleu) et coloration nucléaire morte (vert). Barres d'échelle, 50 µm. h, Analyse quantitative du pourcentage de cellules NucGreen-positives dans chaque condition. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Šídák ***P < 0,001, *P < 0,033 ; NS, non significatif.

Données source

Pour comprendre la contribution d'ATG14 dans la restriction de Mtb, nous avons infecté WT et ATG14 KO iPSDM jusqu'à 96 h avec Mtb WT, ΔcpsA ou ΔesxBA et analysé la réplication bactérienne par imagerie à haut contenu. La réplication de Mtb WT a été significativement améliorée dans ATG14 KO iPSDM par rapport à WT iPSDM à 96 h (Fig. 3a, b). Semblable à l'ATG7 KO iPSDM infecté par Mtb WT, la plupart des ATG14 KO iPSDM ont subi une mort cellulaire après l'infection par Mtb WT, ce qui empêche l'analyse basée sur l'image des cellules fixes. Cependant, par rapport aux macrophages ATG7 KO, le phénotype de réplication et de mort cellulaire dans l'iPSDM dépourvu d'ATG14 était plus prononcé 96 h après l'infection (30 % ATG7 KO contre 50 % dans la mort cellulaire ATG14 KO après 96 h d'infection). Cette augmentation de la réplication de Mtb n'était pas liée à des différences de phagocytose ou de surface bactérienne par cellule après absorption, car les deux paramètres étaient similaires dans les deux origines génétiques (données étendues Fig. 5a, b). Contrairement à l'iPSDM dépourvu d'ATG7, le mutant Mtb ΔesxBA s'est également répliqué plus efficacement dans l'ATG14 KO iPSDM (Fig. 3c, d). Différent de Mtb ΔesxBA, le mutant ΔcpsA était toujours restreint dans ATG14 KO iPSDM (Fig. 3e, f). Dans les cellules non infectées et infectées, ATG14 KO iPSDM a montré des niveaux plus élevés de LC3B-II par rapport à WT iPSDM, suggérant un flux autophagique altéré (Extended Data Fig. 5c) Les niveaux de p62 dans ATG14 KO iPSDM étaient également plus élevés par rapport à WT iPSDM dans toutes les conditions testé, ce qui confirme l'observation antérieure avec LC3B-II (Extended Data Fig. 5c). L'augmentation de la réplication de Mtb WT était associée à une augmentation du nombre de cellules mortes dans ATG14 KO iPSDM, telle que mesurée par la coloration NucGreen, indiquant qu'une réplication bactérienne accrue entraînait la mort des cellules macrophages. En revanche, le phénotype de mort cellulaire amélioré n'a été observé ni dans l'ATG14 KO iPSDM infecté par Mtb ΔesxBA ni par ΔcpsA (Fig. 3g, h).

a,c,e, Instantané d'ATG14+/+ et ATG14−/− iPSDM vivants infectés par Mtb WT (a), ΔesxBA (c) et ΔcpsA (e) à 96 h. Coloration nucléaire (bleu) et Mtb-E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 50 µm. b, d, f, Analyse quantitative à haut contenu de la réplication de Mtb après infection d'ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM avec Mtb WT (b), ΔesxBA (d) et ΔcpsA (f). La surface de Mtb par cellule a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à 2 h après l'infection. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem. Un test t bilatéral non apparié a été utilisé pour les comparaisons **P < 0,002, *P < 0,033 ; NS, non significatif. g, Images représentatives d'ATG14+/+ et ATG14−/− iPSDM non infectés (CTRL) ou infectés par Mtb WT, ΔesxBA et ΔcpsA pendant 96 h. Coloration nucléaire (bleu) et coloration nucléaire morte (vert). Barres d'échelle, 50 µm. h, Analyse quantitative du pourcentage de cellules positives NucGreen dans chaque condition. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaison multiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002. Barres d'échelle, 50 µm.

Données source

Pour définir si les iPSDM ATG14 KO mouraient à cause d'une charge bactérienne élevée ou s'ils devenaient plus permissifs pour la réplication de Mtb après avoir subi la mort cellulaire, nous avons effectué une imagerie cellulaire vivante à haut contenu d'iPSDM infecté par Mtb WT en présence d'iodure de propidium (PI ), une sonde pour la perte d'intégrité de la membrane plasmique14. De la même manière que ce que nous avons observé 96 h après l'infection (Fig. 3g, h), le ratio d'iPSDM PI-positif dépourvu d'ATG14 était six fois plus élevé que dans l'iPSDM WT (Fig. 4a – d et Film supplémentaire 1). La mort cellulaire a augmenté de façon exponentielle après 72 h d'infection dans ATG14 KO iPSDM, ce qui était corrélé à des charges bactériennes élevées (Fig. 4c, d et film supplémentaire 1). Alors que la réplication de Mtb était plus élevée dans ATG14 KO iPSDM à partir de 48 h, l'augmentation de la mort cellulaire n'a été observée qu'à partir de 72 h, suggérant qu'une réplication accrue de Mtb précède la mort cellulaire. Nous avons observé que la majorité des macrophages déficients en ATG14 avec une charge bactérienne élevée perdaient l'intégrité de leur membrane plasmique et devenaient IP positifs. La réplication bactérienne s'est poursuivie après que les cellules ont commencé à fuir, et la plupart des cellules présentant une charge bactérienne accrue ont été compromises. L'analyse quantitative de la réplication bactérienne a capturé une différence prononcée entre WT et ATG14 KO iPSDM. Le changement de facteur dans la réplication bactérienne était de huit fois dans ATG14 KO iPSDM par rapport à quatre fois pour WT iPSDM (Fig. 4a, c). Cela a montré que le changement de pli était sous-estimé avec l'approche d'instantané en direct en raison de la perte de cellules fortement infectées lors de l'étape de coloration de la viabilité. Pour valider nos résultats, nous avons ciblé ATG7 et ATG14 dans le MDM humain en utilisant CRISPR – Cas9 en tant que complexe de ribonucléoprotéine (RNP) composé de protéine Cas9 et d'ARN guide unique (sgRNA) par nucléofection34 (Fig. 4e, f). Après infection de MDM, il y avait des taux de réplication plus élevés avec Mtb WT (2,6 fois) et ΔesxBA (0,3 fois) dans MDM dépourvu d'ATG14 (Fig. 4g) que dans WT (Fig. 4h) ou MDM déficient en ATG7 (Fig. . 4i). Le pool KO d'ATG7 dans MDM a montré une réplication accrue de Mtb WT (1, 1 fois) après 5 jours d'infection par rapport à WT MDM (0, 6 fois) (Fig. 4g, i); cependant, cette augmentation n'a pas été observée pour Mtb ΔesxBA.

a,c, Analyse quantitative à haut contenu de la réplication vivante de Mtb WT dans ATG14+/+ (a) ou ATG14−/− (c) iPSDM. La zone de Mtb (dot plot) et la mort cellulaire (bar plot) ont été calculées en tant que changement de pli, par rapport à l'absorption de Mtb au temps 0 h après l'infection. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes. b, d, micrographies représentatives aux moments indiqués de ATG14+/+ (b) ou ATG14-/- (d) iPSDM infecté par Mtb WT (vert) en présence de PI (rouge). Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes. Barres d'échelle, 50 µm. e, f, Western blot de MDM pool-KO humain pour ATG14 (e) ou ATG7 (f). Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes. g, Analyse quantitative à haut contenu de la réplication vivante de Mtb WT et ΔesxBA dans le MDM humain. La surface de Mtb (dot plot) a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à l'absorption de Mtb au temps 0 h après l'infection. h, i, Analyse quantitative à haut contenu de la réplication vivante de Mtb WT et Mtb ΔesxBA dans un pool-KO de MDM humain nucléofecté pour ATG14 (h) ou ATG7 (i). La surface de Mtb (dot plot) a été calculée en tant que changement de pli, par rapport à l'absorption de Mtb au temps 0 h après l'infection. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes.

Données source

Nous nous sommes ensuite concentrés sur la compréhension si la réplication accrue de Mtb WT était due à un accès cytosolique amélioré. Pour tester cela, nous avons utilisé la galectine-3 (Gal3) comme marqueur, connu pour reconnaître les glycanes luminaux des membranes phagosomales endommagées. Le pourcentage de Mtb WT associé à Gal3 dans ATG7 KO iPSDM n'était pas différent de WT iPSDM (Extended Data Fig. 6a, b). Une association claire de Gal3 avec Mtb WT et ΔcpsA a été observée à la fois dans WT et ATG7 KO iPSDM, alors que pour Mtb ΔesxBA, elle était presque absente (Extended Data Fig. 6a, b). Le pourcentage de phagosomes positifs pour Gal3 contenant Mtb WT et ΔcpsA était plus élevé 2 h après l'infection dans iPSDM déficient pour ATG14 par rapport à WT iPSDM (Fig. 5a, b). Cet effet a été observé aux stades précoces de l'infection, suggérant qu'ATG14 régule l'accès précoce de Mtb au cytosol. Comme prévu, les niveaux de Mtb ΔesxBA Gal3-positif étaient inférieurs à la fois dans WT et ATG14 KO iPSDM et il n'y avait aucune différence entre les génotypes iPSDM pour ΔcpsA ultérieurement après l'infection (Fig. 5a, b). Nous avons ensuite analysé la génération de LC3-TVS, qui sont une conséquence des dommages membranaires induits par Mtb22. En accord avec les résultats de l'association Gal3, le pourcentage de Mtb WT positifs pour LC3-TVS était significativement plus élevé dans ATG14 KO iPSDM, ce qui suggère que la proportion de phagosomes Mtb endommagés était plus élevée (Fig. 5c). Comme prévu, cet effet a également été observé avec le mutant Mtb ΔcpsA mais pas dans les cellules infectées par Mtb ΔesxBA, confirmant le rôle du système de sécrétion ESX-1 (Fig. 5c). Il n'y avait aucune différence dans le recrutement de LC3B à Mtb dans ces cellules (Fig. 5d). Pour confirmer ces observations au niveau ultrastructural, nous avons analysé la localisation bactérienne par microscopie électronique à transmission (MET). L'analyse stéréologique des bactéries cytosoliques a en outre confirmé qu'une fraction plus élevée de Mtb WT était localisée dans le cytosol de l'iPSDM déficient en ATG14 48 h après l'infection (Fig. 5e). Dans les macrophages WT et ATG14 KO, la grande majorité des ΔesxBA étaient localisés dans les phagosomes. Cependant, à la différence des cellules WT, dans ATG14 iPSDM, une petite fraction de ΔesxBA se trouvait dans le cytosol, ce qui était probablement dû à la combinaison de niveaux élevés de bactéries et à l'effet rapporté de PDIM sur les dommages à la membrane du phagosome17,18,35,36.

a, coloration GAL3 dans ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM infecté par Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA. Coloration nucléaire (bleu), GAL3 (vert) et Mtb E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 10 µm. b. Données compilées de trois expériences indépendantes. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002 ; NS, non significatif. c, d, coloration LC3B (en haut) et quantification (en bas) des iPSDM ATG14+/+ ou ATG14−/− infectés par Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA, 2 h après l'infection. Mtb dans les compartiments TVS-LC3B-positif (c) ou LC3B-positif (d). Coloration nucléaire (bleu), LC3B (vert) et Mtb E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 10 µm. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 5 champs indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002 ; NS, non significatif. e, Micrographies électroniques à transmission de Mtb WT ou ΔesxBA dans des emplacements subcellulaires distincts dans les iPSDM ATG14+/+ ou ATG14−/− après 48 h d'infection (à gauche) et quantification stéréologique de la distribution subcellulaire de Mtb WT et ΔesxBA à partir d'images TEM (à droite) . Données compilées de deux expériences indépendantes. Barres d'échelle, 500 nm.

Données source

Les résultats précédents ont fourni une explication du comportement hautement permissif d'ATG14 KO iPSDM vis-à-vis de Mtb WT. Cependant, le taux de réplication plus élevé de Mtb ΔesxBA, qui n'est pas capable d'accéder efficacement au cytosol, était inattendu. De plus, les résultats TEM suggèrent un environnement intra-phagosomal permissif pour la réplication de Mtb ΔesxBA. Pour approfondir cette question, nous avons analysé les Mtb associées à la sonde organite acide LysoTracker (LTR) pendant l'infection et quantifié l'intensité moyenne de la LTR comme mesure de la maturation des phagosomes. Après 2 h d'infection, l'intensité moyenne de la LTR était plus faible pour Mtb WT et ΔesxBA dans l'iPSDM infecté par ATG14 KO (Fig. 6a, b). L'association LTR est restée plus faible pour Mtb WT et ΔesxBA dans ATG14 KO iPSDM même après 24 h d'infection (Fig. 6a, b). En accord avec les résultats de réplication dans ATG7 KO iPSDM, nous n'avons pas observé de différences significatives dans l'intensité LTR associée à Mtb WT ou ΔesxBA dans WT par rapport à ATG7 KO iPSDM (données étendues Fig. 6c, d). Étant donné que Mtb ΔesxBA se trouve principalement dans les phagosomes, ces résultats suggèrent qu'ATG14 est nécessaire à la maturation des phagosomes de Mtb. Pour confirmer ces observations, nous avons généré une souche double reporter qui répond au pH et à la concentration en chlorure de l'environnement (rv2390::mWasabi,pMSP12::E2Crimson)37. Le rapporteur contient le promoteur constitutif pMSP12 pilotant l'expression de E2-Crimson et le promoteur de rv2390 pilotant l'expression de mWasabi en réponse à l'augmentation des concentrations de chlorure [Cl−] et à la diminution du pH dans le phagosome, qui sont des indicateurs de la maturation du phagosome37. Lorsque le rapport mWasabi / E2-Crimson a été analysé dans un iPSDM infecté, nous avons constaté que l'activité du promoteur répondant au pH et au chlorure augmentait de manière significative jusqu'à 48 h (Fig. 6c, d), comme indiqué précédemment dans les macrophages de souris37. En revanche, dans ATG14 KO iPSDM, l'activité du promoteur est restée faible même après 48 h d'infection (Fig. 6c, d). L'inhibition de l'acidification dépendante de la V-ATPase des phagosomes Mtb avec la bafilomycine A1 (BAF) a altéré l'activité du promoteur rv2390 à la fois dans WT et ATG14 KO iPSDM (Fig. 6c, d).

a, Instantané d'ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM vivant infecté par Mtb WT et ΔesxBA coloré avec LTR et colorant NucBlue. Coloration nucléaire (bleu), LTR (vert) et Mtb E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle, 10 µm. b, Analyse quantitative de l'association LTR avec Mtb en tant qu'intensité de fluorescence moyenne (MFI). Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA à une voie suivie du test de comparaisons multiples de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002, *P < 0,033. c, Instantané d'ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM infecté par Mtb exprimant rv2390 ::mWasabi,pMSP12 ::E2-Crimson reporter en présence ou en l'absence de BafA1 (BAF). Barres d'échelle. 10 µm. d, Analyse quantitative de l'activité du promoteur rv2390 en tant que MFI de mWasabi sur E2-Crimson aux moments indiqués d'infection avec ATG14 + / + ou ATG14 - / - iPSDM. Données représentatives d'une des trois expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002 ; NS, non significatif. e, Instantané d'ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM infecté par les souches Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA exprimant rv2390 ::mWasabi, pMSP12 ::E2-Crimson reporter à 48 h d'infection. Barres d'échelle, 10 µm. f, Analyse quantitative de l'activité du promoteur rv2390 en tant que MFI de mWasabi sur E2-Crimson dans les souches Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA aux moments d'infection indiqués avec ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaisons multiples de Šídák. ***P < 0,001 ; NS, non significatif.

Données source

Nous avons ensuite transformé les souches Mtb ΔesxBA et ΔcpsA avec le même reporter et infecté iPSDM. Après infection de WT iPSDM, l'activité du promoteur dans Mtb ΔesxBA était significativement plus élevée que dans Mtb WT (Fig. 6e, f). En revanche, l'activité du rapporteur Mtb ΔesxBA rv2390 :: mWasabi a été considérablement réduite dans ATG14 KO iPSDM (Fig. 6e, f). Semblable à Mtb WT, l'activité du rapporteur rv2390 :: mWasabi dans Mtb ΔcpsA a également été réduite dans ATG14 KO iPSDM puisque Mtb WT et ΔcpsA étaient moins exposés à un pH et [Cl−] bas par rapport à Mtb ΔesxBA (Fig. 6e, f ). Le traitement au BAF a réduit l'activité du rapporteur rv2390 :: mWasabi dans toutes les conditions testées, confirmant que l'activité du rapporteur était dépendante du pH (données étendues Fig. 6e, f).

En utilisant une combinaison d'approches génétiques et d'imagerie, nous montrons que les macrophages humains déficients en autophagie présentent des défauts cruciaux dans le contrôle de Mtb. Notre modèle de macrophage humain fournit un outil permettant d'examiner la fonction de l'autophagie lors d'une infection à Mtb. Il a été rapporté que la perturbation de la voie de l'autophagie par des approches de suppression de gènes augmente de manière significative la réplication de Mtb dans les macrophages de souris in vitro23,24,25, et les données présentées dans cet article fournissent des preuves génétiques que, au moins pour ATG7 et ATG14, c'est aussi le cas des macrophages humains.

Sur les six protéines Atg étudiées dans des modèles de souris, seule Atg5 a un effet substantiel sur l'infection WT Mtb in vivo, telle que mesurée par les unités formant des colonies, l'inflammation et la survie26,38. Cependant, la pathologie observée in vivo est principalement due à une augmentation de l'inflammation neutrophile et à une fonction indépendante de l'autophagie de l'Atg5, via un mécanisme inexpliqué26,38. L'un des arguments pour expliquer ces résultats contradictoires jusqu'à présent est que, in vitro, les différences de réplication ne sont pas importantes et ne se traduisent donc pas directement dans les paramètres in vivo. Bien qu'il ne soit pas clair si un grand nombre de bactéries dans les tissus sont pertinentes dans le contexte de la TB39 humaine, dans nos expériences avec des macrophages humains dépourvus des gènes d'autophagie ATG7 et ATG14, nous avons observé que les cellules étaient très permissives à Mtb et associées à une cellule nécrotique étendue. décès. Les macrophages de souris produisent des niveaux élevés d'oxyde nitrique (NO) dans les poumons, ce qui est essentiel pour le contrôle de la tuberculose in vivo40, et des niveaux élevés de NO pourraient masquer certains des effets dépendants de l'autophagie. De plus, les systèmes de recombinaison Cre-lox utilisés chez la souris pour les KO conditionnels ne sont pas efficaces à 100 % et une certaine autophagie résiduelle pourrait avoir été présente41. Il est important de noter qu'il existe un équilibre délicat entre l'autophagie et la mort cellulaire dans différents contextes et que la suppression conditionnelle in vivo de gènes d'autophagie critiques dans des types de cellules spécifiques pourrait affecter la survie de ces cellules in vivo et épuiser spécifiquement les populations cellulaires. Jusqu'à présent, les modèles in vivo utilisés pour étudier l'autophagie étaient des souris C57BL/6 résistantes à la tuberculose, et il serait important d'étudier le rôle de l'autophagie dans les souches de souris sensibles à la tuberculose telles que les souris C3H/HeBFeJ42 ou B6.Sst1S43 qui présentent des lésions nécrotiques ressemblant mieux à la tuberculose humaine.

Nos données montrent que la restriction et l'induction de la mort cellulaire dépendantes d'ATG7 et d'ATG14 sont principalement associées à l'infection par Mtb WT. Nos données appuient la notion selon laquelle ATG7 et ATG14 contrôlent la réplication des bactéries cytosoliques soit par la recapture des bactéries du cytosol22, soit par le scellement des phagosomes endommagés par des autophagosomes, comme indiqué pour Salmonella44. Le mutant Mtb ΔcpsA est capable d'endommager la membrane phagosomale, mais il est possible que l'atténuation se produise à des étapes antérieures de l'infection ou que le mutant Mtb ΔcpsA soit incapable de se répliquer efficacement dans le cytosol en raison de défauts inconnus, par exemple, acquisition de nutriments .

Nos expériences génétiques KO suggèrent que ni l'autophagie canonique ni non canonique n'est requise pour le contrôle du mutant Mtb ΔcpsA dans les macrophages humains. Les macrophages de souris Atg7 KO étaient incapables de restreindre Mtb ΔcpsA jusqu'à 72 h après l'infection12. Cependant, dans iPSDM, Mtb ΔcpsA a montré une réplication atténuée à la fois dans l'ATG7 KO, qui est déficient en autophagie canonique et non canonique, et dans les macrophages ATG14 KO, qui sont altérés pour l'autophagie canonique mais non non canonique. Dans les macrophages de souris, il a été démontré que l'atténuation du mutant Mtb CpsA KO est due à l'augmentation du recrutement de la NADPH oxydase et à la production de ROS phagosomiques conduisant au LAP. Différent des résultats dans les macrophages primaires de souris, dans iPSDM, Mtb ΔcpsA a recruté la NADPH oxydase à des niveaux similaires à ceux de Mtb WT 2 h après l'infection. Cet écart pourrait être dû à des différences entre les macrophages de souris et humains, les protocoles de différenciation et le patrimoine génétique des souches parentales de Mtb utilisées. Les souches utilisées dans cette étude sont toutes dérivées de la même souche parentale et testées pour le statut PDIM, ce qui nous permet de comparer directement les résultats phénotypiques lors de l'infection. Dans ce contexte, des études complémentaires et la caractérisation de sa localisation sont nécessaires pour définir le mécanisme précis par lequel le mutant Mtb ΔcpsA est restreint dans les macrophages humains.

Nous proposons que ATG7 et ATG14 agissent à différentes étapes du mode de vie intracellulaire de Mtb dans les macrophages humains. Alors que les macrophages ATG7 KO ont montré un changement significatif dans la réplication de Mtb WT et la mort cellulaire induite par Mtb, le KO d'ATG14, qui ne perturbe que l'autophagie canonique mais laisse intacte l'autophagie non canonique, a conduit à une réplication accrue plus prononcée de Mtb WT et le mutant Vtt ΔesxBA. Il existe des preuves que l'ATG14 régule la fusion entre les autophagosomes et les lysosomes45 et a également une fonction dans la voie endosomale qui est indépendante de l'autophagie46. Nous avons constaté qu'ATG14 régule également la fusion entre les phagosomes et les lysosomes contenant Mtb dans les macrophages, mais les mécanismes régulant ce processus doivent être étudiés plus avant. Nos résultats soulèvent des questions sur les liens possibles entre la maturation des phagosomes et l'accès cytosolique, comme le montre Dyctiostelium21. Une diminution de la maturation des phagosomes est-elle le résultat d'un endommagement accru de la membrane ? Ou est-ce que la maturation réduite des phagosomes conduit à des lésions membranaires accrues et à un accès cytosolique accru ? D'autres études définiront comment ces événements sont régulés temporellement.

Au total, nos données ont révélé que ATG7 et ATG14 sont nécessaires pour contrôler l'infection de Mtb par les macrophages, montrant que les protéines de l'autophagie régulent différentes étapes : ATG7 et ATG14 régulant le contrôle de Mtb cytosolique et ATG14 en plus de la fusion des phagosomes de Mtb avec des lysosomes. Comprendre comment l'autophagie agit pour contrôler l'infection des agents pathogènes intracellulaires chez l'homme permettra le développement de thérapies dirigées vers l'hôte.

Mtb H37Rv (Mtb WT) a été fourni par le professeur Douglas Young (The Francis Crick Institute, UK). Des mutants de délétion Mtb pour cpsA (rv3484) ou esxB et esxA (rv3874 et rv3875) ont été construits à l'aide d'ORBIT47. Pour chaque mutant, les transformants ont été vérifiés par PCR (tableau supplémentaire 1) et confirmés par séquençage du génome entier. La complémentation de la délétion du gène cpsA a été réalisée par l'expression du gène Mtb H37Rv cpsA sous le contrôle du promoteur hsp60 à partir du site MS6 dans le chromosome. La complémentation de la suppression des gènes esxBA a été obtenue en plaçant à la fois l'expression de Mtb H37Rv esxB et esxA sous le contrôle du promoteur Psmyc30 du site MS6 dans le chromosome. Des souches fluorescentes ont été conçues pour exprimer E2-Crimson à partir de pTEC19 (Addgene #30178, du professeur Lalita Ramakrishnan). Les souches double rapporteur de Mtb ont été construites par expression épisomique de E2-Crimson à partir du même promoteur constitutif que dans pTEC19 et le gène mWasabi amplifié à partir du vecteur pTEC15 (Addgene #30174, du Prof. Lalita Ramakrishnan) a été placé sous le contrôle du chlorure - et promoteur rv2390c ​​sensible au pH bas37,48. Les souches de Mtb ont été cultivées dans du Middlebrook 7H9 (Sigma-Aldrich, M0178) additionné de 0,2 % de glycérol (Fisher Chemical, G/0650/17), 0,05 % de Tween-80 (Sigma-Aldrich, P1754) et 10 % d'ADC (BD Biosciences, 212352). Marqueurs de sélection appropriés 50 µg ml-1 d'hygromycine (Invitrogen, 10687010), 25 µg ml-1 de kanamycine (Sigma-Aldrich, K1876) ou 25 µg ml-1 de zéocine (Invivogen, ant-zn-05) ont été utilisés si nécessaire.

Trente millilitres de culture mycobactérienne en phase logarithmique ont été centrifugés pendant 5 min à 2 000 g à température ambiante. Le surnageant a été retiré et filtré deux fois avec un filtre de 0,22 pm. Le culot a été lavé avec du tampon de lavage (PBS-Tween-80 0,05% ou PBS-Tyloxapol 0,05%), puis avec du PBS. Le culot a été remis en suspension dans 500 ul de PBS contenant un inhibiteur de protéase et transféré dans un tube à bouchon à vis de 2 ml rempli au 1/3 de billes de verre (Sigma, G-1145). Les échantillons ont été ribolysés au réglage 6,5 pendant 30 s, puis placés sur de la glace pendant 5 min et centrifugés deux fois à 4 000 g pendant 1 min à 4 °C. Le surnageant restant a été centrifugé à 4 000 g pendant 10 min à 4 ° C et 500 μl ont été transférés dans un filtre centrifuge Millipore Ultrafree-MC. Les échantillons ont été filtrés deux fois avec un filtre centrifuge Millipore Ultrafree-MC à 4 000 g pendant 5 min à 4 °C.

Les CSPi humaines EIKA2 et KOLF2 provenaient des Public Health England Culture Collections (numéros de catalogue 77650059 et 77650100, respectivement) et conservées dans des plaques revêtues de Vitronectin XF (StemCell Technologies, 100–0763) avec le milieu Essential 8 (Gibco, A1517001). Les cellules ont été authentifiées par profilage STR et vérifiées mensuellement pour la contamination par Mycoplasma. Les cellules ont été passées en utilisant Versene (Gibco, 15040066). Des usines de monocytes ont été mises en place selon un protocole précédemment rapporté32. Les corps embryonnaires (EB) ont été nourris quotidiennement avec deux fois 50% de changements de milieu avec E8 complété avec 50 ng ml-1 hBMP4 (Peprotech, 120-05), 50 ng ml-1 hVEGF (Peprotech, 100-20) et 20 ng ml -1 hSCF (Peprotech, 300-07) pendant 3 jours. Au jour 4, les EB ont été collectés et ensemencés à 100–150 EB par T175 ou 250–300 par flacon T225 dans un milieu d'usine XVIVO ou un milieu d'usine OXM (tableau supplémentaire 2). Ces usines de monocytes ont été alimentées chaque semaine pendant 5 semaines jusqu'à ce que des monocytes soient observés dans le surnageant. Jusqu'à 50 % du surnageant a été recueilli chaque semaine et centrifugé à 300 g pendant 5 min. Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu de différenciation XVIVO ou un milieu de différenciation OXM (tableau supplémentaire 2). Les monocytes ont été étalés à 4 × 106 cellules par boîte de Pétri de 10 cm pour se différencier sur 7 jours ; au jour 4, un changement de milieu de 50 % a été effectué. Pour se détacher, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS (pH 7,4), puis incubées avec du Versene pendant 15 min à 37 °C et 5 % de CO2 avant de diluer 1 :3 avec du PBS et de gratter doucement. Les macrophages ont été centrifugés à 300 g et étalés pour les expériences.

Dix millilitres de culture logarithmique ont été inactivés pendant 2 h à 95°C dans 1 ml de PBS. Après trois lavages à l'eau, les surnageants des incubations successives dans du chloroforme:méthanol (2:1) et du méthanol:chloroforme (1:1) ont été regroupés et séchés à 55°C. Les lipides séchés ont ensuite été remis en suspension dans du chloroforme, résolus sur une plaque de gel de silice avec un mélange de solvants éther de pétrole: acétate d'éthyle (98: 2) et visualisés avec de l'acide phosphomolybdique à 5% dans de l'éthanol contre des PDIM purifiés (H37Rv, Purified Phthiocerol Dimycocerosate, BEI Resources, NR-20328) et une souche défectueuse dans la synthèse PDIM49 comme témoins positifs et négatifs, respectivement.

La stratégie KO basée sur CRISPR-Cas9 a utilisé quatre sgARN flanquant des exons de gènes spécifiques pour obtenir une délétion d'une séquence génomique. Les sgARN ciblant ATG7 et ATG14 ont été conçus et sélectionnés à l'aide de l'outil de conception WGE CRISPR (www.sanger.ac.uk/htgt/wge/)50. La nucléofection des iPSC EIKA2 a été réalisée à l'aide de l'Amaxa 4D-Nucleofector (V4XP-3024, Lonza) pour obtenir des clones ATG7 KO. Les iPSC ATG7 KO étaient viables et ne présentaient aucun déficit de réplication, bien que les étapes de formation d'EB et de production de monocytes aient été variables. Pour chaque nucléofection, 1 × 106 de CSPi humaines ont été remises en suspension dans 100 µl de tampon P3 (Lonza, V4XP-3024) contenant 20 µg de Sp Cas9 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3, 1081059, IDT) mélangé avec un total de 16 µg d'ARN à guide unique synthétiques modifiés chimiquement (Synthego) (tableau supplémentaire 3). Les cellules et le mélange Cas9 – RNP ont ensuite été nucléofectés avec le programme CA-137. Après la nucléofection, des clones uniques ont été sélectionnés manuellement51 et criblés par un test basé sur la PCR (pour les séquences, voir le tableau supplémentaire 1). La nucléofection des iPSC KOLF2 pour obtenir les clones ATG14 KO et ATG7 KO a été réalisée comme ci-dessus.

Les cellules ont été collectées et incubées dans du PBS/0,1 % BSA (Cell Signaling Technologies, 9998S) et 5 µl de bloc Fc par million de cellules pendant 20 min. Cinquante microlitres de cellules ont été incubés avec 50 µl de cocktail d'anticorps dilués dans du PBS/0,1 % de BSA pendant 20 min sur de la glace dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées dans 2 ml de PBS et fixées dans du paraformaldéhyde à 2 % (PFA ; Electron Microscopy Sciences, 15710). Les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux LSRII. Les anticorps ont été achetés auprès de BD Biosciences et sont détaillés dans le tableau supplémentaire 4. Les données de cytométrie en flux ont été analysées et tracées dans FlowJo (BD Biosciences).

iPSDM ont été ensemencés à une densité de 50 000 cellules par puits d'une plaque 96 puits, 150 000 cellules par puits d'une plaque 24 puits, 500 000 cellules par puits d'une plaque 12 puits et 1 × 106 cellules par puits d'une plaque 6-puits. bien assiette. Les cultures bactériennes en phase logarithmique moyenne (OD600 0,5–1,0) ont été centrifugées à 2 000 g pendant 5 min et lavées deux fois dans du PBS. Les culots ont ensuite été secoués vigoureusement pendant 1 min avec des billes de verre de 2, 5 à 3, 5 mm (VWR, 332124 G) et les bactéries remises en suspension dans 10 ml de milieu de culture de macrophages avant d'être centrifugées à 300 g pendant 5 min pour éliminer les gros amas. Les 7 ml supérieurs de suspension bactérienne ont été prélevés, la DO600 a été enregistrée et la suspension a été diluée de manière appropriée pour l'infection. Après 2 h d'absorption, les bactéries extracellulaires ont été éliminées avec deux lavages dans du PBS et les macrophages ont été incubés à 37 ° C et 5 % de CO2. Au moment requis après l'infection, les cellules ont été collectées ou fixées dans du PFA à 4 %. Une multiplicité cible d'infection (MOI) de 1 a été utilisée pour toutes les expériences, en supposant que la DO600 de 1 est de 1 × 108 bactéries ml-1. Le traitement à la bafilomycine A1 a été effectué parallèlement à l'infection avec une concentration finale de 100 nM et maintenu présent jusqu'au dernier moment.

Les cellules ont été préparées à partir de cônes de leucocytes (NC24) fournis par le NHS Blood and Transplant service14. Les globules blancs ont été isolés par centrifugation sur Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, 17-5442-03) pendant 60 min à 300 g. Les cellules mononucléaires ont été recueillies et lavées deux fois avec une solution de rinçage MACS (Miltenyi, 130-091-222) pour éliminer les plaquettes et les globules rouges. Les échantillons restants ont été incubés avec 10 ml de tampon de lyse RBC (Sigma, R7757) par culot pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec un tampon de rinçage et remises en suspension dans 80 µl de solution de rinçage MACS additionnée de 1 % de BSA (Miltenyi, 130-091-376) (MACS/BSA) et de 20 µl de billes magnétiques anti-CD14 (Miltenyi, 130-050-201 ) pour 108 cellules. Après 20 min sur de la glace, les cellules ont été lavées dans une solution MACS/BSA et remises en suspension à une concentration de 108 cellules pour 500 µl dans une solution MACS/BSA et ensuite passées à travers une colonne LS (Miltenyi, 130-042-401) dans le champ de un aimant séparateur QuadroMACS (Miltenyi, 130-090-976). La colonne LS a été lavée trois fois avec une solution MACS/BSA, puis les cellules CD14 positives ont été éluées, centrifugées et remises en suspension dans du RPMI 1640 complet avec GlutaMAX et HEPES (Gibco, 72400-02) et 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Sigma, F7524).

Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et électroporées dans la solution de nucléofection primaire appropriée (Kit Amaxa Human Monocyte Nucleofector, n° de catalogue VPA-1007) à l'aide du Lonza 2b Nucleofector (Nucleofector 2b Device, AAB-1001). Un total de 5 × 106 cellules ont été utilisées par réaction et remises en suspension dans 100 µl de solution de nucléofection primaire contenant 4 µg de Sp Cas9 (IDT) mélangés à un total de 12 µg d'ARN à guide unique synthétiques modifiés chimiquement (Synthego) (Supplémentaire Tableau 3). Les MDM ont ensuite été nucléofectés avec le pool d'ARNsg et le mélange Cas9 – RNP à l'aide du programme Y001. Les cellules nucléofectées ont été cultivées dans du RPMI 1640 préchauffé additionné de GlutaMAX, HEPES et 10 % de FBS dans une plaque à six puits. Deux heures après la nucléofection, 100 ng ml-1 hM-CSF ont été ajoutés aux cellules. Les boîtes ont été incubées dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% de CO2. Après 3 jours, un volume égal de milieu complet frais comprenant 100 ng ml-1 hM-CSF a été ajouté. Après 6 jours, les macrophages différenciés ont été détachés dans 0,5 mM d'EDTA dans du PBS glacé à l'aide de grattoirs cellulaires (Sarsted, 83.1830), culottés par centrifugation et remis en suspension dans du milieu RPMI contenant 10 % de FBS34.

Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, lysées sur de la glace dans un tampon RIPA (Millipore, 20-188) contenant un inhibiteur de protéase complet sans EDTA (Thermo Fisher Scientific, 78445) et bouillies à 95-100 ° C pendant 20 min dans un échantillon LDS ( Thermo Fisher Scientific, NP008) et NuPage Sample Reducing Agent (Thermo Fisher Scientific, NP009). Les échantillons ont été chargés dans un gel Bis-Tris à 4–12% (Thermo Fisher Scientific, WG1403BOX) et l'électrophorèse a été réalisée à 100 V pendant 120 min. Les gels ont été transférés sur une membrane PVDF à l'aide d'un iBlot2 (Thermo Fisher Scientific, IB21001) en utilisant le programme P0. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé en poudre à 5 % dans du TBS plus 0,05 % de Tween20 (TBS-T) pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C. Les membranes ont été lavées dans du TBS-T et incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été développées avec un réactif de chimiluminescence amélioré (Bio-Rad) et imagées sur un Amersham GE Imager 680 (GE Healthcare). L'échelle de masse moléculaire provenait d'Abcam (116028).

Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis incubées pendant 2 h dans du milieu complet ou privées d'acides aminés avec une solution saline équilibrée de Hanks (Thermo Fisher Scientific, 14170088) avec ou sans 100 nM de bafilomycine A1 (Merck, B1793-10UG) ou 50 µM monensine (Sigma Aldrich, M5273-5G). Les anticorps utilisés étaient p62 (5114), Atg7 (8558), Atg14 (5504 S), β-actine-HRP (12262) de Cell Signaling Technologies, LC3B (ab48394), anti-ESAT6 (EsxA, ab26246), anti-CFP10 ( EsxB, ab45074) et anti-Ag85 (ab36731) d'Abcam, et anti-lapin-IgG conjugué à HRP (W4011) et anti-souris-IgG conjugué à HRP (W4021) de Promega.

Les cellules ont été fixées dans du PFA à 4 % dans du PBS, trempées avec du NH4Cl 50 mM dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,3 %, du FBS à 5 % dans du PBS pendant 30 min. Les anticorps ont été dilués dans du PBS contenant 5 % de FBS et incubés pendant 1 h à température ambiante. Entre les anticorps, les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS. Les noyaux ont été colorés pendant 10 min avec du DAPI (ThermoFisher, D1306) dilué au 1/10 000 dans du PBS. Les lamelles ont été montées sur des lames de verre avec un milieu de montage DAKO (DAKO, S3023). Les anticorps utilisés étaient Alexa Fluor 488 anti-souris/humain Mac-2 (Galectin-3) (BioLegend, 125410, 1:500), anti-LC3B (MBL, PM036, 1:100), p40 Phox (Millipore, 07– 503, 1:100) et anti-lapin-Alexa Fluor 488 (Life Technologies, A11034, 1:500).

Les lamelles ont été imagées à l'aide d'un microscope confocal inversé Leica SP8 (Leica Microsystems) avec un objectif à immersion dans l'huile à ouverture numérique (NA) de 63 × 1,4. La fluorescence a été détectée à l'aide de détecteurs HyD. Les réglages du laser et du détecteur ont été maintenus constants entre les conditions pour chaque répétition biologique d'une expérience.

Après 72 ou 96 h d'infection, les cellules ont été colorées pendant 30 min à l'aide du kit d'imagerie de viabilité cellulaire Blue/Green ReadyProbes (Invitrogen, R37609) en suivant les recommandations du fabricant. Pour l'imagerie des points temporels 2, 24 et 48 h après l'infection, seul le réactif NucBlue ReadyProbes (Thermo Fisher Scientific, R37605) a été utilisé. L'imagerie des cellules vivantes a été réalisée à l'aide d'un microscope OPERA Phenix (Perkin Elmer) avec un objectif à immersion dans l'eau 40 × 1, 1 NA avec un chevauchement de 10% entre les champs adjacents, trois puits par condition par expérience. La segmentation et l'analyse ont été effectuées à l'aide du logiciel Harmony (Perkin Elmer, version 4.9) où la projection maximale des plans z individuels avec une distance approximative de 1 µm a été utilisée pour effectuer une segmentation unicellulaire en combinant les fonctions « Trouver des noyaux » et « Trouver des cellules ». blocs de construction. Pour quantifier la réplication de Mtb, les bactéries ont été détectées par le bloc de construction "Find Spots" d'Harmony. Pour déterminer la zone bactérienne pour chaque cellule, la zone de tache a été additionnée pour chaque cellule segmentée. La surface bactérienne moyenne par cellule de chaque point temporel et condition a été importée dans R Studio (The R Project for Statistical Computing, version 1.3.1073). Les résultats ont ensuite été exportés sous forme de fichier .csv. La croissance de Mtb en tant que changement de pli a été calculée par la formule suivante : (surface moyenne de Mtb par cellule pour le point temporel à - surface moyenne de Mtb par cellule à t2h)/(surface moyenne de Mtb par cellule à t2h).

Pour évaluer la mort cellulaire, la segmentation et l'analyse ont été effectuées avec le logiciel Harmony où la projection maximale des plans z individuels avec une distance approximative de 1 µm a été utilisée pour effectuer une segmentation unicellulaire par le bloc de construction « Trouver des noyaux ». Le nombre de noyaux totaux a été calculé, puis les noyaux positifs pour NucGreen ont été calculés en fixant un seuil d'intensité Alexa Fluor 488. Le pourcentage de mort cellulaire a été déterminé en divisant le nombre de noyaux verts par le nombre total de noyaux.

Un total de 50 000 macrophages ont été ensemencés par puits sur une plaque à 96 puits à fond d'oléfine. Les cellules ont été infectées par Mtb à un MOI de 1 pendant 2 h. Après infection, les cellules ont été lavées avec du PBS et remplacées par un milieu contenant 0, 4 µg ml-1 PI (Abcam, ab14083). L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope OPERA Phenix (Perkin Elmer) avec un objectif à immersion dans l'eau 40 × 1, 1 NA avec un chevauchement de 10% entre les champs adjacents. Cinq avions avec une distance de 1 µm de plus de 20 champs de vision ont été surveillés au fil du temps, et des instantanés ont été pris toutes les 1,5 h pendant 96 h. Pour évaluer la réplication bactérienne et la mort cellulaire, l'analyse a été effectuée avec le logiciel Harmony où la projection maximale des plans z individuels avec une distance approximative de 1 µm a été utilisée. Pour effectuer la segmentation cellulaire, le bloc de construction "Find Texture Regions" a été formé dans le canal Brightfield pour segmenter les zones cellulaires. Suite à la segmentation de la zone cellulaire, les blocs de construction «Find Spots» et «Find kernels» ont été utilisés pour segmenter les noyaux Mtb et PI-positifs. Pour déterminer la zone bactérienne et les noyaux PI-positifs au fil du temps, la zone de tache et le nombre de noyaux PI-positifs ont été additionnés pour chaque point de temps. La croissance de Mtb en tant que changement de pli a été calculée par la formule suivante : (somme de la surface intracellulaire de Mtb pour le point de temps - somme de la surface intracellulaire de Mtb à t0h)/(somme de la surface intracellulaire de Mtb à t0h). La mort cellulaire en tant que changement de pli a été calculée par la formule suivante : (somme des noyaux PI-positifs pour le point temporel - somme des noyaux PI-positifs à t0h)/(somme des noyaux PI-positifs à t0h).

Les images ont été acquises à l'aide du système Opera Phenix. Les cellules ont été colorées dans des plaques de visualisation à fond de verre à 96 puits ou dans une plaque à 96 puits à fond d'oléfine et imagées avec un objectif à immersion dans l'eau 63 × 1, 15 NA. La segmentation a été réalisée à l'aide du logiciel Harmony. Le signal DAPI d'un seul plan z a été détecté à l'aide du bloc de construction "Find Nuclei", le bloc de construction suivant "Find Spots" a été utilisé pour effectuer la segmentation bactérienne. L'association Gal3 a été calculée manuellement ; cinq champs avec plus de 100 cellules ont été analysés pour chaque condition. Pour quantifier l'association LC3B et LC3-TVS à Mtb, les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal inversé Leica SP8 avec un objectif à immersion dans l'huile 63 × 1, 4 NA. La quantification de l'association Mtb et LC3-TVS a été effectuée manuellement à l'aide du logiciel open source ImageJ/Fiji v1.53a, et cinq champs avec plus de 100 cellules ont été analysés pour chaque condition.

Les échantillons ont été fixés en ajoutant un fixateur à double concentration (2,5 % de glutaraldéhyde et 8 % de formaldéhyde dans 200 mM HEPES, pH 7,4) au milieu de culture pendant 30 min à température ambiante, puis remplacés par 1,25 % de glutaraldéhyde et 4 % de formaldéhyde dans 200 mM HEPES pendant la nuit. à 4 °C. Les échantillons ont été traités dans un Biowave Pro (Pelco) en utilisant l'énergie des micro-ondes et le vide. En bref, les cellules ont été lavées deux fois dans HEPES (Sigma-Aldrich H0887) et post-fixées à l'aide d'un mélange de tétroxyde d'osmium à 2 % (Taab O011) et de ferricyanure de potassium à 1,5 % (Taab, P018) (v/v). Les échantillons ont été lavés quatre fois avec de l'eau distillée et colorés avec une solution aqueuse à 2 % d'acétate d'uranyle (Agar Scientific AGR1260A), puis lavés comme précédemment. Les échantillons ont été déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol par étapes de 50 %, 75 %, 90 % et 100 %, puis retirés du plastique de culture tissulaire avec de l'oxyde de propylène, lavés quatre fois dans de l'acétone sèche et transférés dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Les échantillons ont été infiltrés avec une série de dilutions de 50 %, 75 % et 100 % de résine époxy Ultra Bed Low Viscosity (EMS) dans un mélange d'acétone et centrifugés à 600 g entre les changements. Enfin, les échantillons ont été durcis pendant un minimum de 48 h à 60 °C.

Des coupes ultrafines (~60 nm) ont été réalisées avec un ultramicrotome EM UC7 (Leica Microsystems) à l'aide d'un couteau diamanté ultrasonique oscillant à 35° (DiaTOME) à une vitesse de coupe de 0,6 mm s−1, une fréquence réglée en mode automatique et une tension de 6,0 V. Les images ont été acquises à l'aide d'un VTEM 120k 1400FLASH avec une caméra Matataki CCD.

Analyse stéréologique des cellules infectées par Mtb : Au moins 33 cellules infectées différentes par groupe ont été imagées à un grossissement ×3 900 par échantillonnage systématique et aléatoire. Les points de croisement de la grille de test stéréologique sur les bactéries ont été comptés en ce qui concerne la localisation subcellulaire des bactéries, qui a été déterminée à partir d'images prises à un grossissement minimum de × 16 000. Les critères suivants ont été suivis pour l'évaluation de l'implication de la membrane subcellulaire : (1) seule membrane environnante, c'est-à-dire que les bactéries étaient, au moins partiellement, étroitement bordées par une bicouche phospholipidique, représentant la membrane phagosomale ; (2) cytosolique, c'est-à-dire que les bactéries étaient entourées de ribosomes, représentant le cytoplasme sans indication de la membrane phagosomale ; (3) plusieurs membranes environnantes, c'est-à-dire que les bactéries étaient enveloppées par des structures membranaires doubles ou multiples.

Les cellules ont été infectées avec Mtb WT ou ΔesxBA à un MOI de 1 comme décrit précédemment. Les cellules infectées ont été lavées une fois avec du PBS et colorées avec un milieu contenant 200 nM de LysoTracker Green DND-26 (LTR; Invitrogen, L7526) et le réactif NucBlue ReadyProbes (Invitrogen, R37605) conformément aux recommandations du fabricant. La segmentation et l'analyse ont été effectuées à l'aide du logiciel Harmony comme ci-dessus. Le signal DAPI d'un seul plan z a été détecté à l'aide du bloc de construction «Find Image Region», puis le bloc de construction «Find Spots» a été utilisé pour effectuer la segmentation bactérienne. Chaque région d'intérêt individuelle a été transformée en masque et étendue à l'aide du bloc de construction "Rechercher les régions environnantes" avec un seuil individuel de 0,8 et incluant la région d'entrée. Ce masque a été utilisé pour déterminer l'intensité moyenne LTR associée à chaque région Mtb. L'intensité moyenne de LTR associée à chaque Mtb a été calculée, et la moyenne de chaque point de temps et condition a été importée dans RStudio. Les résultats ont ensuite été exportés sous forme de fichier .csv.

L'analyse du rapporteur pH / chlorure exprimant Mtb (rv2390 :: mWasabi, pMSP12 :: E2-Crimson) a été réalisée à l'aide du logiciel Harmony. La segmentation et l'analyse ont été effectuées sur la projection maximale des plans z individuels avec une distance approximative de 0,5 µm. Le signal DAPI de tous les plans z a été détecté à l'aide des blocs de construction «Find Nuclei» et «Find Cytoplasm» pour effectuer avec précision la segmentation cellulaire. Les signaux des canaux mWasabi et E2-Crimson ont été détectés à l'aide du bloc de construction "Find Image Region" ou du bloc de construction "Find Spot" où un seuil manuel a été appliqué pour définir avec précision les objets bactériens. Le signal des canaux mWasabi et E2-Crimson a été fusionné à l'aide de "Calculer l'image" et de la fonction "Par formule" en appliquant une opération de canal A + B. Pour chaque objet bactérien, l'intensité de fluorescence moyenne de mWasabi et E2-Crimson a été déterminée avec le bloc de construction des propriétés d'intensité calculées. L'activité du rapporteur pour chaque objet bactérien a été calculée en générant une sortie de formule de l'intensité moyenne mWasabi par objet sur l'intensité moyenne E2-Crimson par objet. La moyenne de chaque condition a ensuite été exportée sous forme de fichier .csv.

Tous les graphiques ont été produits et des analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism Version 9.4.0 (GraphPad Software LLC). Les figures ont été compilées à l'aide d'Adobe Illustrator 2022 Version 26.2.1 (Adobe).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Toutes les autres données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Toutes les analyses ont été effectuées de manière reproductible à l'aide de scripts R accessibles au public.

Deretic, V. Autophagie dans l'immunité et la défense cellulaire autonome contre les microbes intracellulaires. Immunol. Rév. 240, 92–104 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gutierrez, M., Master, S. & Singh, S. L'autophagie est un mécanisme de défense inhibant la survie du BCG et de Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages infectés. Cellule 119, 753–766 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nakagawa, I. et al. L'autophagie défend les cellules contre l'invasion du streptocoque du groupe A. Sciences 306, 1037-1040 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Huang, J. & Brumell, JH Interaction bactéries-autophagie: une bataille pour la survie. Nat. Rév. Microbiol. 12, 101–114 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay, S. & Philips, JA phagocytose associée à LC3 : défense de l'hôte et réponse microbienne. Courant. Avis. Immunol. 60, 81-90 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Knodler, LA & Celli, J. Manger les étrangers à l'intérieur: contrôle de l'hôte des bactéries intracellulaires via la xénophagie. Microbiol cellulaire. 13, 1319-1327 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia, J. et al. La galectine-3 coordonne un système cellulaire pour la réparation et l'élimination lysosomales. Dév. Cellule 52, 69–87 e68 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Thurston, TL, Ryzhakov, G., Bloor, S., von Muhlinen, N. & Randow, F. L'adaptateur TBK1 et le récepteur d'autophagie NDP52 limitent la prolifération des bactéries recouvertes d'ubiquitine. Nat. Immunol. 10, 1215-1221 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fiskin, E., Bionda, T., Dikic, I. & Behrends, C. Analyse globale de l'ubiquitinome hôte et bactérien en réponse à une infection à Salmonella typhimurium. Mol. Cellule 62, 967–981 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Otten, EG et al. Ubiquitylation du lipopolysaccharide par RNF213 lors d'une infection bactérienne. Nature 594, 111-116 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez, J. et al. La caractérisation moléculaire de la phagocytose associée à LC3 révèle des rôles distincts pour Rubicon, NOX2 et les protéines d'autophagie. Nat. Cell Biol. 17, 893–906 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koster, S. et al. Mycobacterium tuberculosis est protégé de la NADPH oxydase et de la phagocytose associée à LC3 par la protéine LCP CpsA. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 114, E8711–E8720 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bussi, C. & Gutierrez, MG Mycobacterium tuberculosis infection des cellules hôtes dans l'espace et le temps. Microbiol FEMS. Rév. https://doi.org/10.1093/femsre/fuz006 (2019).

Lerner, TR et al. Mycobacterium tuberculosis se réplique dans les macrophages humains nécrotiques. J. Cell Biol. https://doi.org/10.1083/jcb.201603040 (2017).

Simeone, R. et al. La rupture phagosomale par Mycobacterium tuberculosis entraîne une toxicité et la mort de la cellule hôte. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Wel, N. et al. M. tuberculosis et M. leprae passent du phagolysosome au cytosol dans les cellules myéloïdes. Cellule 129, 1287-1298 (2007).

Article PubMed Google Scholar

Augenstreich, J. et al. ESX-1 et les dimycocérosates de phthiocérol de Mycobacterium tuberculosis agissent de concert pour provoquer la rupture phagosomale et l'apoptose des cellules hôtes. Cellule. Microbiol. 19, 1–19 (2017).

Article Google Scholar

Lerner, TR et al. Les dimycocérosates de phthiocérol favorisent l'accès au cytosol et à la charge intracellulaire de Mycobacterium tuberculosis dans les cellules endothéliales lymphatiques. BMC Biol. 16, 1 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Quigley, J. et al. Le lipide PDIM de la paroi cellulaire contribue à l'évasion phagosomale et à la sortie de la cellule hôte de Mycobacterium tuberculosis. mBio 8, e00148–17 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barczak, AK et al. L'analyse systématique et multiparamétrique de l'infection intracellulaire par Mycobacterium tuberculosis offre un aperçu de la virulence coordonnée. PLoS Pathog. 13, e1006363 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez-Jimenez, AT et al. L'ESCRT et les machineries d'autophagie coopèrent pour réparer les dommages dépendants d'ESX-1 au niveau de la vacuole contenant Mycobacterium, mais ont un impact opposé sur la maîtrise de l'infection. PLoS Pathog. 14, e1007501 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bernard, EM et al. L'infection à M. tuberculosis de macrophages humains dérivés d'iPSC révèle une dynamique membranaire complexe lors de l'évasion de la xénophagie. J. Cell Sei. 134, jcs252973 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Franco, LH et al. L'ubiquitine ligase Smurf1 fonctionne dans l'autophagie sélective de Mycobacterium tuberculosis et dans la défense anti-tuberculeuse de l'hôte. Microbe hôte cellulaire 21, 59–72 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Manzanillo, PS et al. PARKIN ubiquitine ligase médie la résistance aux pathogènes intracellulaires. Nature 501, 512-516 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watson, RO, Manzanillo, PS & Cox, JS L'ADN extracellulaire de M. tuberculosis cible les bactéries pour l'autophagie en activant la voie de détection de l'ADN de l'hôte. Cellule 150, 803–815 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimmey, JM et al. Rôle unique de l'ATG5 dans l'immunopathologie médiée par les neutrophiles lors d'une infection à M. tuberculosis. Nature 528, 565-569 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Behar, SM & Baehrecke, EH Tuberculose : l'autophagie n'est pas la réponse. Nature 528, 482–483 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chandra, P. et al. Mycobacterium tuberculosis inhibe le recrutement de RAB7 pour moduler sélectivement le flux d'autophagie dans les macrophages. Sci. Rep. 5, 16320 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Romagnoli, A. et al. Altération dépendante d'ESX-1 du flux autophagique par Mycobacterium tuberculosis dans les cellules dendritiques humaines. Autophagie 8, 1357–1370 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaps, I. et al. Transfert d'énergie entre protéines fluorescentes à l'aide d'un système de co-expression chez Mycobacterium smegmatis. Gène 278, 115-124 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Florey, O., Gammoh, N., Kim, SE, Jiang, X. & Overholtzer, M. La V-ATPase et les déséquilibres osmotiques activent la lipidation endolysosomale de LC3. Autophagie 11, 88–99 (2015).

Article PubMed Google Scholar

van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J. & Cowley, SA Production efficace et à long terme de macrophages dérivés de monocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions partiellement définies et entièrement définies. PLoS ONE 8, e71098 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hall-Roberts, H. et al. La variante R47H de TREM2 Alzheimer provoque une dysrégulation transcriptionnelle similaire à l'inactivation, mais uniquement des phénotypes fonctionnels subtils dans les macrophages humains dérivés d'iPSC. Alzheimer Res. Là. 12, 151 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hiatt, J. et al. Génération efficace de cellules myéloïdes humaines primaires isogéniques à l'aide de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9. Cell Rep. 35, 109105 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barczak, AK et al. L'analyse systématique et multiparamétrique de l'infection intracellulaire par Mycobacterium tuberculosis offre un aperçu de la virulence coordonnée. PLoS Pathog. 13, 1–27 (2017).

Article Google Scholar

Quigley, J. et al. Le lipide PDIM de la paroi cellulaire contribue à l'évasion phagosomale et à la sortie de la cellule hôte de Mycobacterium tuberculosis. mBio 8, 1–12 (2017).

Article Google Scholar

Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, RB, Parish, T. & Russell, DG Mycobacterium tuberculosis répond au chlorure et au pH en tant qu'indices synergiques du statut immunitaire de sa cellule hôte. PLoS Pathog. 9, e1003282 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Castillo, EF et al. L'autophagie protège contre la tuberculose active en supprimant la charge bactérienne et l'inflammation. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 109, E3168–E3176 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flynn, JL Leçons tirées des infections expérimentales à Mycobacterium tuberculosis. Les microbes infectent. 8, 1179-1188 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

MacMicking, JD et al. Identification de l'oxyde nitrique synthase comme locus protecteur contre la tuberculose. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 94, 5243–5248 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt-Supprian, M. & Rajewsky, K. Les aléas du ciblage conditionnel des gènes. Nat. Immunol. 8, 665–668 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kramnik, I., Dietrich, WF, Demant, P. & Bloom, BR Contrôle génétique de la résistance à l'infection expérimentale par Mycobacterium tuberculosis virulent. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 97, 8560–8565 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, DX et al. La susceptibilité induite par l'interféron de type I à Mycobacterium tuberculosis est médiée par l'IL-1Ra. Nat. Microbiol 4, 2128–2135 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreibich, S. et al. Les protéines d'autophagie favorisent la réparation des membranes endosomales endommagées par le système de sécrétion de Salmonella de type trois 1. Cell Host Microbe 18, 527–537 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Diao, J. et al. ATG14 favorise l'attache membranaire et la fusion des autophagosomes aux endolysosomes. Nature 520, 563-566 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HJ et al. La protéine d'autophagie interagissant avec Beclin-1 Atg14L cible la protéine Snapin associée à SNARE pour coordonner le trafic endocytaire. J. Cell Sei. 125, 4740–4750 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murphy, KC et al. ORBIT : un nouveau paradigme pour le génie génétique des chromosomes mycobactériens. mBio 9, e01467-18 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Takaki, K., Davis, JM, Winglee, K. et Ramakrishnan, L. Évaluation de la pathogenèse et du traitement de l'infection à Mycobacterium marinum chez le poisson zèbre. Nat. Protocole 8, 1114-1124 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Astarie-Dequeker, C. et al. Les dimycocérosates de phthiocérol de M. tuberculosis participent à l'invasion des macrophages en induisant des changements dans l'organisation des lipides de la membrane plasmique. PLoS Pathog. 5, e1000289 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hodgkins, A. et al. WGE : une base de données CRISPR pour l'ingénierie des génomes. Bioinformatique 31, 3078–3080 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skarnes, WC, Pellegrino, E. & McDonough, JA Amélioration de l'efficacité de la réparation dirigée par l'homologie dans les cellules souches humaines. Méthodes 164–165, 18–28 (2019).

Article PubMed Google Scholar

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Nous sommes reconnaissants à l'Unité des cellules souches embryonnaires humaines, au STP de microscopie électronique et au STP de microscopie optique avancée pour leur soutien dans divers aspects du travail. Nous remercions C. Bourges et J. Lee (The Francis Crick Institute) pour leur aide à la nucléofection des cellules primaires. Ce travail a été soutenu par le Francis Crick Institute (à MGG), qui reçoit son financement de base de Cancer Research UK (FC001092), le UK Medical Research Council (FC001092) et le Wellcome Trust (FC001092). Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne (accord de subvention numéro 772022). Aux fins du libre accès, l'auteur a appliqué une licence de droit d'auteur public CC BY à toute version du manuscrit accepté par l'auteur résultant de cette soumission. CB a reçu un financement de l'European Respiratory Society et du programme de recherche et d'innovation H2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Sklodowska-Curie numéro 713406. PS est soutenu par une bourse de longue durée FEBS non rémunérée et a reçu un financement de l'Union européenne. Programme de recherche et d'innovation H2020 dans le cadre de la convention de subvention Marie Sklodowska-Curie SpaTime_AnTB numéro 892859.

Elliott M. Bernard

Adresse actuelle : Département d'immunobiologie, Université de Lausanne, Epalinges, Suisse

Pierre Santucci

Adresse actuelle : Aix-Marseille Université, CNRS, LISM, Marseille, France

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino.

Interactions hôte-pathogène dans le laboratoire de la tuberculose, The Francis Crick Institute, Londres, Royaume-Uni

Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino, Laure Botella, Antony Fearns, Natalia Athanasiadi, Claudio Bussi, Pierre Santucci & Maximiliano G. Gutierrez

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MGG a conçu le projet et a été le superviseur principal de l'étude. BA, EMB et EP ont réalisé des expériences et analysé les données. LB a généré et caractérisé toutes les souches de Mtb utilisées dans ce travail. AF a effectué l'analyse par microscopie électronique. NA, CB et PS ont contribué à la culture de cellules souches et à la production de macrophages. MGG a rédigé le projet initial et BA a préparé les chiffres. BA, EMB et EP ont révisé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Maximiliano G. Gutierrez.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Maziar Divangahi et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Représentation schématique de la stratégie ATG7−/− CRISPR. Les cercles bruns montrent l'orientation de la séquence PAM et les lignes vertes indiquent les sgARN utilisés pour cibler les introns flanquant l'exon 2 et l'exon 3 d'ATG7. Les flèches noires montrent l'amorce (GF2 et GR2) utilisée pour génotyper les clones uniques après ciblage. b, c, Western blot représentatif de LC3B, p62 et ATG7 dans ATG7+/+, ATG7−/− iPSC (b) et iPSDM (c) après famine en présence ou en l'absence de 100 nM BafA1, 100 nM BafA1 seul ou 50 µM monensin pendant 2 h. d, Représentation schématique de l'orientation de la stratégie ATG14−/− CRISPR. Les cercles bruns montrent l'orientation de la séquence PAM et les lignes vertes indiquent les sgARN utilisés pour cibler l'intron flanquant l'exon 5 d'ATG14. Les flèches noires montrent les amorces (GF1 et GR1) utilisées pour génotyper les clones uniques après ciblage. e,f, Western blot représentatif de LC3B, p62 et ATG14 dans ATG14+/+, ATG14−/− iPSC (e) et iPSDM (f) après famine en présence ou en l'absence de 100 nM BafA1, 100 nM BafA1 seul ou 50 µM monensin pendant 2 h. Western blots représentatifs de trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

Données source

Caractérisation par cytométrie en flux des monocytes et macrophages WT, ATG14 et ATG7 KO. Le nom des marqueurs est indiqué en haut de chaque colonne de graphiques et le génotype des cellules est indiqué au début de chaque ligne. Le rose représente l'isotype témoin et le bleu le marqueur correspondant.

Données source

a, le graphique de gauche montre l'analyse quantitative de la zone Mtb WT ou DesxBA dans les iPSDM ATG7−/− ou ATG7+/+ 2 h après l'infection. Le graphique de droite montre le pourcentage de cellules infectées à 2, 24, 48, 72 et 96 h après l'infection à partir du même réplicat biologique. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. (b) Le graphique de gauche représente la quantification de la zone Mtb WT ou DcpsA dans les iPSDM ATG7−/− ou ATG7+/+ 2 h après l'infection. Le graphique de droite montre le pourcentage de cellules infectées à 2, 24, 48, 72 et 96 h après l'infection à partir du même réplicat biologique. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. ( c ) Analyse Western blot des niveaux d'ATG7, p62 et LC3B dans les iPSDM ATG7 + / + et ATG7 − / − à 2 h, 24 h ou 48 h d'infection avec Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA. Western blots représentatifs de deux répliques biologiques indépendantes (n = 2).

Données source

a, iPSDM ont été infectés avec Mtb WT, DcpsA ou DcpsA: cpsA pendant 2 h, 24 h et 48 h et colorés pour p40 Phox par immunofluorescence indirecte. Images représentatives du recrutement de p40 Phox pour chaque souche, aux moments indiqués. Les images sont représentatives de trois répétitions biologiques indépendantes. Barres d'échelle : 10 µm. b, Analyse quantitative du recrutement de p40 Phox dans WT Mtb, DcpsA ou DcpsA:cpsA. Les données sont moyennes ± SD de trois répétitions biologiques indépendantes. ANOVA à un facteur suivi avec le test de comparaisons multiples de Šídák *p < 0,033, ns = non significatif.

Données source

a, le graphique de gauche montre l'analyse quantitative de la zone Mtb WT ou DesxBA dans les iPSDM ATG14-/- ou ATG14+/+ 2 h après l'infection. Le graphique de droite montre le pourcentage de cellules infectées à 2, 24, 48, 72 et 96 h après l'infection à partir du même réplicat biologique. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. (b) Le graphique de gauche représente la quantification de la zone Mtb WT ou DcpsA dans les iPSDM ATG14−/− ou ATG14+/+ 2 h après l'infection. Le graphique de droite montre le pourcentage de cellules infectées à 2, 24, 48, 72 et 96 h après l'infection à partir du même réplicat biologique. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. ( c ) Analyse par Western blot des niveaux d'ATG14, p62 et LC3B dans les iPSDM ATG14 + / + et ATG14 − / − à 2 h, 24 h ou 48 h d'infection avec Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA. Western blots représentatifs de trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

Données source

a, Images représentatives de la localisation endogène de Gal-3 dans ATG7+/+ ou ATG7−/− iPSDM infecté par Mtb WT, Mtb ΔesxBA ou Mtb ΔcpsA. Les images montrent la coloration nucléaire (bleu), GAL3 (vert) et Mtb E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle : 10 µm. b, Quantification manuelle de l'association Gal-3 avec Mtb WT, Mtb ΔesxBA ou Mtb ΔcpsA après 2 h, 24 h ou 48 h d'infection. Données compilées de 3 expériences indépendantes. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Šídák ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, ns = non significatif. c, Images représentatives d'ATG7+/+ ou ATG7−/− iPSDM infectées par Mtb WT et Mtb ΔesxBA colorées avec LysoTracker et colorant NucBlue et imagées en mode direct après 2 h et 24 h d'infection par imagerie à haute teneur. Les images montrent la coloration nucléaire (bleu), LysoTracker (vert) et Mtb E2-Crimson (rouge). Barres d'échelle : 10 µm. d, Analyse quantitative de l'association LTR avec Mtb en tant qu'intensité de fluorescence moyenne. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Šídák, ns = non significatif. e, Images représentatives d'ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM infecté par des souches Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA exprimant rv2390 :: mWasabi, pMSP12 :: E2-Crimson reporter en présence de 100 nM BafA1 à 48 h d'infection. f, analyse quantitative de l'activité du promoteur rv2390 dans les souches Mtb WT, ΔesxBA ou ΔcpsA aux moments indiqués d'infection avec ATG14+/+ ou ATG14−/− iPSDM en présence de 100 nM BafA1 a été calculée comme un facteur de changement de mWasabi MFI sur E2 -Crimson MFI pour un événement bactérien unique. Données représentatives d'une des deux expériences indépendantes (n = 3 puits indépendants).

Données source

Légende de la vidéo supplémentaire 1 et des tableaux 1 à 4.

Imagerie en direct de la réplication de Mtb dans WT et ATG14 KO iPSDM : L'imagerie a été réalisée à l'aide du microscope OPERA Phenix avec un objectif à immersion dans l'eau 40 × 1,1 NA avec un chevauchement de 10 % entre les champs adjacents. La projection maximale de cinq plans avec une distance de 1 µm à partir d'un seul champ de vision a été surveillée toutes les 1,5 h pendant 96 h. Pour l'imagerie sur l'Opera Phenix, le fond clair a été détecté en utilisant λex = transmission/λem = 650–760 nm, PI (rouge) a été détecté en utilisant λex = 561 nm/λem = 570–630 nm et E2-Crimson Mtb (vert) a été détecté en utilisant λex = 640 nm/λem = 650–760 nm en utilisant une caméra scMOS 16 bits.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données de cytométrie en flux.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

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Réimpressions et autorisations

Aylan, B., Bernard, EM, Pellegrino, E. et al. ATG7 et ATG14 limitent la réplication cytosolique et phagosomale de Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages humains. Nat Microbiol 8, 803–818 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Reçu : 24 janvier 2022

Accepté : 24 janvier 2023

Publié: 23 mars 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Microbiologie de la nature (2023)