La microfluidique d'affinité permet une - Pékin résine époxy Co., Ltd

Communications Biology volume 5, Article number: 1147 (2022) Citer cet article

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La dégradation des protéines médiée par la voie ubiquitine-protéasome régule les événements de signalisation dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques. Les essais de dégradation in vitro ont joué un rôle déterminant dans la compréhension de la façon dont la prolifération cellulaire et d'autres processus cellulaires fondamentaux sont régulés. Ces tests sont directs, spécifiques au temps et très informatifs mais aussi laborieux, reposant généralement sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à faible débit suivie d'une autoradiographie ou d'un immunotransfert. Nous présentons la dégradation des protéines sur puce (pDOC), une technologie microfluidique intégrée basée sur MITOMI pour la découverte et l'analyse de la dégradation des protéines dans des extraits acellulaires. La plate-forme accueille des centaines de microchambres sur lesquelles la dégradation des protéines est dosée rapidement, simultanément et en utilisant des quantités infimes de réactifs dans un ou plusieurs environnements physiochimiques. Essentiellement, pDOC fournit une alternative multiplex sensible au test de dégradation conventionnel, avec un intérêt pour la recherche biomédicale et translationnelle associée à la protéolyse régulée.

La dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome est un module de régulation central à travers lequel le niveau de protéines dans toutes les cellules eucaryotes reste équilibré. Un écart par rapport à la quantité souhaitée de chaque protéine à un moment donné peut être préjudiciable à la cellule, entraînant des tissus dysfonctionnels et un large éventail de maladies chez l'homme, notamment le cancer, la fibrose kystique et les troubles neurodégénératifs1,2.

La cascade principale sous-jacente à l'ubiquitination implique trois enzymes : L'enzyme E1 se lie de manière covalente et active la molécule d'ubiquitine pour le transfert à une enzyme de conjugaison E2. Ensuite, l'E2 conjugué à l'ubiquitine interagit avec une enzyme E3 ubiquitine-ligase, qui catalyse le transfert des molécules d'ubiquitine de l'E2 à la protéine cible, généralement via une liaison isopeptide à un résidu lysine. Des événements d'ubiquitination répétitifs peuvent former une ou plusieurs chaînes de fragments d'ubiquitine sur la protéine cible (c'est-à-dire la polyubiquitination). Une chaîne de polyubiquitine reconnue par le protéasome déclenche la dégradation des protéines1,2. Des centaines d'enzymes E3 différentes régissent l'énorme portée fonctionnelle et la spécificité de l'ensemble du processus d'ubiquitination. En ce qui concerne la prolifération cellulaire et la régulation du cycle cellulaire, le complexe/cyclosome promoteur d'anaphase des ubiquitine ligases (APC/C) et le complexe protéique Skp1-Cullin-F-box (SCF) sont particulièrement importants3,4,5. La spécificité de substrat des deux complexes dépend des co-activateurs : Cdc20 et Cdh1 pour l'APC/C et l'une des nombreuses protéines F-box pour le SCF, par exemple, Skp2 et β-TrCP6,7,8. Dans l'ensemble, la protéolyse ordonnée médiée par les enzymes E3 régulées par le cycle cellulaire assure un cycle cellulaire unidirectionnel chez tous les eucaryotes6,7,8,9,10.

Alors que certaines formes de chaînes d'ubiquitine marquent les protéines pour la dégradation par le protéasome, la monoubiquitination et d'autres formes de polyubiquitination régulent les cascades de signalisation via des voies indépendantes du protéasome11. De plus, l'ubiquitination peut être inversée par des enzymes appelées déubiquitinases d'une manière qui peut empêcher la protéolyse12. D'un autre côté, la dégradation du protéasome peut ne pas toujours être couplée à l'ubiquitination13. Ainsi, la dégradation des protéines ne peut pas être déduite de l'ubiquitination et doit être déterminée directement.

Les essais de dégradation des protéines dans des extraits acellulaires, également connus sous le nom de «systèmes acellulaires», ont joué un rôle déterminant dans la recherche en biologie cellulaire, permettant des analyses directes et quantitatives de la protéolyse médiée par l'ubiquitine dans des environnements physiologiquement pertinents. En fait, une grande partie des principes du cycle cellulaire ont été découverts en surveillant la dégradation des protéines du cycle cellulaire dans des extraits d'œufs de grenouille ou de cellules humaines en cycle (voir par exemple14,15,16,17,18,19,20). L'utilisation intensive de ces « tests de dégradation » dans l'ère moderne d'aujourd'hui témoigne de leur efficacité (voir par exemple21,22,23). Fait intéressant, les tests de dégradation conventionnels n'ont jamais vraiment bénéficié des technologies modernes et reposent toujours sur l'électrophorèse sur gel, l'autoradiographie ou l'immunotransfert et une grande quantité de matériel biologique.

La microfluidique intégrée et les microvalves pneumatiques ont ouvert la voie aux puces à protéines dans lesquelles les protéines en réseau sont fraîchement exprimées dans des lysats de réticulocytes qui maintiennent le repliement et l'activité appropriés des protéines24. Les protéines cibles sont exprimées sur puce ou à l'extérieur, puis immobilisées dans des microchambres via une chimie de surface désignée. Ensuite, un large panel d'analyses fluorométriques peut être effectué sur des milliers de microchambres, en utilisant des quantités infimes de réactifs. Ces dernières années, nous avons développé plusieurs applications basées sur le piégeage mécaniquement induit des interactions moléculaires (MITOMI), pour l'analyse in situ multiplexée des modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) et des interactions non covalentes24,25,26,27,28,29,30.

La combinaison de la microfluidique intégrée, des réseaux de protéines et des systèmes sans cellules recèle un grand potentiel dans la recherche biomédicale. Dans cette étude, nous démontrons une plate-forme basée sur MITOMI pour la détection et la quantification de la dégradation des protéines dans des extraits acellulaires. La méthode, nommée « pDOC » (dégradation des protéines sur puce), fournit une alternative rapide et multiplex à la méthode classique par laquelle la protéolyse médiée par le protéasome a été dosée in vitro de manière presque invariable depuis près d'un demi-siècle.

Le vecteur pCS2-Flag-FA a été généré en annelant des oligos d'étiquettes Flag et en ligaturant le fragment final dans le vecteur pCS2-FA en utilisant les sites d'enzymes de restriction (RE) BamHI et Fsel. Les plasmides variants pCS2-Flag-FA-Securin-GFP wt et ∆64 ont été générés en clonant wt ou ∆64 Securin-GFP27 dans le vecteur pCS2-Flag-FA, en utilisant les amorces flanquées FseI (5 ') et AscI (3'). Le plasmide pCS2-FA-Geminin-GFP a été décrit27. pCS2-FA-Geminin∆27-GFP a été généré en amplifiant le cadre de lecture ouvert (ORF) de Geminin-GFP à partir du codon de la méthionine 28 en utilisant les amorces flanquées Fsel (5') et AscI (3'). Le produit de PCR a été recloné dans le vecteur pCS2-FA. Les plasmides pCS2-Flag-FA-Geminin-GFP wt et ∆27 variant ont été générés en clonant chacun des deux variants Geminin-GFP dans le vecteur pCS2-Flag-FA en utilisant les sites Fsel et AscI RE. Le fragment Flag-p27-myc a été généré par une PCR d'assemblage en deux étapes en utilisant la matrice pCS2-Flag-FA-p27-GFP, un premier ensemble d'amorces contenant une étiquette Flag (5') et une étiquette Myc (3'), et un deuxième jeu d'amorces contenant un promoteur T7 (5') et une séquence de terminaison T7 (3'). L'extrémité N-terminale de la géminine (110 acides aminés) attachée au monomère Azami-Green (mAG) a été amplifiée à l'aide d'une matrice décrite précédemment et d'un ensemble d'amorces flanqué de sites FseI (5 ') et AscI (3') RE. Le produit de PCR a été cloné dans le plasmide pcS2FA-FLAG. Ce dernier a été utilisé comme matrice pour générer un variant ∆27 par mutagenèse (kits Agilent QuikChange® Lightning ; 210513). Des substitutions de K à A et de RxxL à GxxV (code d'acide aminé unique) ont été générées par mutagenèse. Voir le tableau supplémentaire 1 pour plus de détails. Mis à part mAG-Geminin, toutes les protéines marquées GFP portaient une variante améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP). Voir le tableau supplémentaire 1 pour les séquences oligo.

Les cellules NDB sont basées sur la lignée cellulaire HEK293. Une description détaillée de ce système cellulaire peut être trouvée dans la réf. 17. Les cellules NDB et HeLa S3 (ATCC ; # CCL-2.2) ont été maintenues dans des boîtes de culture tissulaire contenant du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine (Industries biologiques ; #01-055-1A, #04-001-1A, #03-020-1B, #03-031-1B). Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Les cellules HeLa S3 ont été cultivées soit sur des boîtes, soit dans des flacons spinner en verre de 1 litre en suspension (80 rpm). Les cellules NDB ont été cultivées en présence de 5 μg/ml de blasticidine (Life Technologies ; #A11139-03) pour maintenir le plasmide pcDNA6/TR portant l'ORF pour le répresseur Tet.

Pour la synchronisation tardive de la mitose, les cellules NDB ont été cultivées dans des boîtes de 150 mm/diamètre. Après avoir atteint une confluence d'environ 75 %, les cellules ont été traitées avec 1 μg/ml de tétracycline (Sigma-Aldrich ; #87128) pendant 22 h et récoltées pour la préparation de l'extrait. Pour la synchronisation en phase S, les cellules HeLa S3 ont été cultivées en suspension pendant 72 h jusqu'à une concentration d'environ 5 × 105 cellules/ml. Les cellules ont ensuite été additionnées de thymidine 2 mM pendant 22 h, lavées avec du DMEM (deux fois, 5 min, 250 × g) et libérées dans du milieu frais préchauffé (37 ° C) pendant 9 h supplémentaires. La culture cellulaire a ensuite été complétée à nouveau avec 2 mM de thymidine pendant 19 h avant la récolte pour la préparation de l'extrait.

Extraits HeLa S3 : des cellules HeLa S3 synchrones en phase S ont été lavées avec du PBS 1 x glacé et lysées dans un tampon de gonflement (HEPES 20 mM, pH 7,5, MgCl2 2 mM, KCl 5 mM, dithiothréitol [DTT] 1 mM, et cocktail inhibiteur de protéase [Roche; #11836170001]) additionné d'un mélange régénérateur d'énergie, E-mix (1 mM ATP, 0,1 mM éthylène glycol-bis [β-aminoéthyl éther]-N,N,N′,N′-tétra acétique [EGTA], MgCl2 1 mM, phosphate de créatine 7,5 mM, 50 μg/ml de créatine phosphokinase). Les cellules ont été incubées sur de la glace pendant 30 min et homogénéisées par des cycles de congélation-décongélation dans de l'azote liquide et passées à travers une aiguille 21-G pendant 10 fois. Les extraits ont été clarifiés par centrifugation ultérieure (17 000 × g; 10 et 40 min) et conservés à –80 °C. Extraits mitotiques NDB : les cellules NDB induites par Tet ont été collectées à partir de 20 à 24 boîtes de 150 mm par lavage doux avec du PBS glacé. Des extraits ont été préparés comme décrit ci-dessus pour les cellules HeLa S3. Pour plus de détails, voir17,32.

Les protéines cibles ont été exprimées in vitro à l'aide d'un lysat de réticulocytes de lapin (système de réticulocytes couplés au TNT ; Promega ; #L4600, #L4610) complété avec un mélange de 35S-méthionine/SL-cystéine (PerkinElmer ; #NEG772002MC) pour la détection par radiographie ou avec de la méthionine non marquée. (Promega #L118A) et FluoroTect™ GreenLys (Promega #L5001).

Les tests de dégradation ont été effectués dans 20 μl d'extrait cellulaire additionné de 1 μl de mélange régénérant d'énergie 20 × (voir ci-dessus), 1 μl de solution Ub à 10 mg / ml (Boston Biochem; # U-100H) et 1 μl radiomarqué traduit in vitro protéine d'intérêt. Pour un contrôle négatif, le mélange réactionnel a été additionné d'inhibiteur de protéasome MG132 (20 μM; Boston Biochem; #I-130). Les mélanges réactionnels ont été incubés à 28 ° C et des échantillons de 4 à 5 µl ont été prélevés à des intervalles de 15 à 20 minutes. Détection hors puce : les échantillons ponctuels ont été mélangés avec du tampon d'échantillon Laemmli 4 × (BIO-RAD #1610747), dénaturés (10 min, 95 °C) et résolus par SDS-PAGE. Les gels ont été trempés dans une solution fixatrice de méthanol / acide acétique (10/7, 5%) pendant 20 min, séchés sous vide et à la chaleur, et exposés à un écran phosphoreux (Fuji) pendant 24 à 72 h. Les protéines traduites in vitro ont été visualisées par autoradiographie à l'aide du Phosphorimager Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences). L'intensité du signal (corrigée pour le signal de fond) a été mesurée par le logiciel ImageJ et a été normalisée au signal à t0. Toutes les parcelles ont été créées à l'aide du logiciel Microsoft Excel, version 16.20. Les valeurs moyennes et SE ont été calculées à partir de trois ou quatre tests de dégradation indépendants. Détection sur puce : Les échantillons ponctuels ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide. Avant la détection, les échantillons ont été décongelés sur de la glace, passés à travers la puce pendant 5 min et immobilisés dans des chambres à protéines sous la valve « bouton » (voir « Chimie de surface » ci-dessous). Ensuite, les vannes «bouton» ont été fermées, permettant au matériau non lié d'être lavé par du PBS. Le niveau de protéines cibles (avant et après les réactions de dégradation) a été déterminé par une excitation à 488 nm et un filtre d'émission à 535/25 nm. Le niveau de protéines pourrait également être mesuré par immunofluorescence en utilisant des anticorps marqués par fluorescence (anti-Flag-Alexa 647, μg/ml, #15009 ; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Ces anticorps ont été versés dans le dispositif et incubés avec les protéines immobilisées sous le « bouton » pendant 20 min à température ambiante. Les anticorps non liés ont été lavés mécaniquement par du PBS après la fermeture de la valve « bouton ». Ici, les niveaux de protéines cibles ont été déterminés par une excitation à 633 nm et un filtre d'émission à 692/40 nm.

Le dispositif microfluidique est constitué de deux couches de PDMS. Les tranches de silicium sont écrites par photolithographie (Heidelberg MLA 150). Puis après, la phase de lithographie douce est réalisée à l'aide d'élastomère de silicium polydiméthylsiloxane (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) et de son durcisseur pour fabriquer les dispositifs microfluidiques. Les dispositifs microfluidiques sont constitués de deux couches de PDMS alignées, les couches de flux et de contrôle qui sont préparées à l'aide de différents ratios de PDMS et de son agent de durcissement ; 5:1 et 20:1 pour les couches de contrôle et de flux, respectivement. La couche témoin est dégazée et cuite pendant 30 min à 80 °C. La couche d'écoulement est initialement spin-coated (Laurell, USA) à 2000 rpm pendant 60 s et cuite à 80 ° C pendant 30 min. Ensuite, les couches d'écoulement et de contrôle sont alignées à l'aide d'une machine d'alignement automatique (faite sur mesure) sous un stéréoscope et cuites pendant 1,5 h à 80 ° C pour le collage final. Le dispositif à deux couches est ensuite décollé de la plaquette et lié à une lamelle couvre-objet par traitement plasma (air, 30 %, 30 s). Pendant le fonctionnement, l'appareil est connecté à un collecteur pneumatique, à l'aide de tubes Tygon® et est automatiquement actionné en fonction d'un ensemble programmé de commandes.

La BSA biotinylée (1 μg/μl, Thermo) est coulée pendant 25 min à travers le dispositif, permettant sa liaison à la surface époxy. Au-dessus de la BSA biotinylée, 0, 5 μg / μl de NutraAvidin (Pierce, Rockford, IL) est ajouté (écoulement pendant 20 min). La valve « bouton » est ensuite fermée et du PEG biotinylé (1 μg/μl, (PG2-AMBN-5k, Nanocs Inc.) est coulé pendant 20 min, en passivant la couche d'écoulement, à l'exception de la zone des boutons. Suite à la passivation , la valve « bouton » est relâchée et un flux de 0,2 μg/μl d'anticorps anti-GFP biotinylés (Abcam ; #ab6658, Cambridge, Royaume-Uni) ou 0,01 µg/µl d'anticorps anti-Flag biotinylés (Cell Signaling ; #2908 S Danvers , MA, USA) ont été appliqués. Les anticorps liés à la NutraAvidin exposée, spécifiquement à la zone sous le « bouton », créant un réseau d'étiquettes anti-GFP ou anti-drapeau. Le tampon PBS a été utilisé pour le lavage entre les étapes. Dans le cas de l'immobilisation de p27, la chimie de surface a été réalisée avec 0,2 μg/ml d'anticorps anti-IgG entiers biotinylés anti-souris d'âne (#715-065-150, Jackson Immuno research Laboratories, Maryland, USA) suivi d'un flux de 20 min de 6,5 μg/ml d'anticorps anti p27 (Santa Cruz biotechnology, Heidelberg Allemagne ; souris #1641).

Les produits Flag-Securin-GFP (wt et ∆64 mut) et p27-GFP IVT ont été introduits dans la puce et immobilisés à la surface sous le « bouton » au niveau des chambres à protéines via son étiquette GFP, suivis d'un lavage au tampon PBS et scannés. Ensuite, les vannes «bouton» ont été ouvertes et les mélanges réactionnels d'extrait ont été incubés avec les chambres à protéines pendant 60 min (30 ° C). Au cours de la réaction, le niveau de la protéine cible restante a été déterminé par signal GFP toutes les 15 min. La baisse du signal GFP en corrélation avec la dégradation. Après soustraction du signal de fond, les signaux GFP ont été normalisés au signal à t0 (valeur de 1) ou entre 1 (signal max) et 0 (signal min).

Le scanner de puces à ADN rechargé par LS, le logiciel d'analyse d'images GenePix7.0 (Molecular Devices) et ImageJ ont été utilisés pour l'analyse et la présentation des images. Le signal mesuré autour de la valve à bouton a été considéré comme le bruit de fond, car aucune immobilisation de protéines n'y était attendue. Pourtant, un certain signal de fond est toujours détecté, ce qui résulte de la fixation non spécifique d'anticorps à la surface du dispositif. Nous avons soustrait le signal de fond autour des boutons dans un anneau de la taille de 2 R avec un espacement de 2 pixels (voir matériel supplémentaire in27).

Les échantillons de protéines ont été mélangés avec du tampon Laemmli x4, dénaturés (10 min, 96 ° C) et résolus sur un gel d'acrylamide à 10% fraîchement préparé à l'aide d'un tampon de course Tris-glycine. Les protéines ont ensuite été électro-transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad; #162-0115) en utilisant le système de transfert Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). La solution Ponceau S (Sigma-Aldrich; #81462) a été utilisée pour vérifier la qualité du transfert. La membrane a été lavée (TBS), bloquée (5 % de lait écrémé dans du TBST) et incubée (RT, 1 h) avec une solution d'anticorps (2,5 % de BSA et 0,05 % d'azoture de sodium dans du PBS) avant d'être buvardée avec de l'anti-Securin (Abcam ; # AB3305) anticorps primaire (RT, 2 h). L'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort anti-souris a été acheté auprès de Jackson ImmunoResearch (#115-035-003). Le signal ECL a été détecté en utilisant EZ-ECL (Biological Industries; #20-500-171).

Dans l'ensemble, des détails sur la conception expérimentale et les statistiques sont donnés dans les sections pertinentes. Les valeurs P ont été calculées sur la base d'un test t bilatéral non apparié. Dans les analyses de gel réalisées en triple exemplaire ; les graphiques représentent les valeurs moyennes et d'erreur standard (SE). Les statistiques pour l'analyse sur puce ont été dérivées de n = 10 à 57 unités de cellule. Les valeurs moyennes et SE sont indiquées. L'analyse statistique et les graphiques ont été générés à l'aide du logiciel Microsoft Excel v16.65.

Nous avons conçu pDOC pour prendre en charge plusieurs stratégies d'analyse de la dégradation des protéines in vitro, en particulier des systèmes acellulaires. Le dispositif est basé sur une puce microfluidique intégrée MITOMI, développée à l'origine pour quantifier les interactions protéine-ligand à l'équilibre24,33. Le module MITOMI a été modifié pour contenir un réseau de 16 × 64, 32 × 32 ou 32 × 16 microcompartiments. Cette dernière puce a également été conçue pour permettre un chargement parallèle (voir les schémas de la Fig. 1a). Chaque compartiment, c'est-à-dire l'unité cellulaire (Fig. 1b), est séparé en deux chambres et contrôlé par trois vannes : une vanne "col" qui contrôle la diffusion (mélange) du matériau de la chambre I dans la "chambre protéique", dans laquelle une protéine cible spécifique est piégée ; une vanne « sandwich » qui sépare les unités cellulaires ; et la valve «bouton» MITOMI, qui emprisonne les molécules en interaction en dessous, prenant ainsi un instantané de l'interaction à l'équilibre (Fig. 1b). La chambre I peut être chargée de l'une des deux manières suivantes : 1) chargement "de type gel", qui permet un chargement séquentiel ou parallèle de 32 échantillons. Ceci est réalisé par un ensemble de canaux d'entrée individuels contrôlés par des micro-vannes. L'avantage de cette approche est le délai d'obtention des résultats plus court, sa simplicité relative et la similitude conceptuelle avec les protocoles conventionnels à base de gel. 2) Le chargement de microréseaux, c'est-à-dire que les fermes de lecture ouvertes (ORF) pré-marquées sont transcrites sur puce pour générer un réseau de protéines fraîchement exprimées. Cette approche augmente le débit. Non moins important, il réduit les consommations de réactifs d'au moins 3 ordres de grandeur par rapport au dosage conventionnel. Chaque réaction est inférieure à un nanolitre en volume. Le collecteur commun est ensuite utilisé pour charger des matériaux communs dans les différentes sections du dispositif (par exemple, pour la chimie de surface). De plus, les conceptions de puces pDOC incluent la séparation de la commande principale des trois vannes en sections de la puce qui peuvent être activées et contrôlées indépendamment. Par rapport au contrôle de chaque type de valve pour l'ensemble de la puce, cette séparation améliore non seulement la réponse de la valve, mais plus important encore, elle permet des analyses de réponse temporelle sur la puce. Dans chaque section, des expériences peuvent être effectuées dans toutes les unités cellulaires en parallèle, permettant des applications multiplexées du type montré dans nos dispositifs précédents24,25,26,34.

a pDOC est une plateforme microfluidique basée sur MITOMI. L'appareil comprend des couches de flux (vert) et de contrôle (magenta), et plusieurs modules : 1) un collecteur commun permettant le chargement de matériaux, qui, en combinaison avec un microréseau, peut permettre jusqu'à 512 expériences différentes ; 2) Entrées de chargement parallèles permettant un chargement semblable à un gel de jusqu'à 32 conditions expérimentales différentes ; et 3) module MITOMI de 512 unités cellulaires, qui contrôle le processus de dosage de la dégradation. b Une illustration de deux unités cellulaires. Chaque unité de cellule (marquée par un cadre en pointillé noir) comprend deux chambres contrôlées par trois vannes pneumatiques intégrées. Le volume total de chaque unité est d'environ 1 nanolitre. Les deux chambres sont séparées par la «valve à col» (I). Différentes unités cellulaires sont séparées par des vannes sandwich (II). Les échantillons contenant des protéines cibles (produits IVT) sont chargés dans la chambre à protéines et immobilisés via des anticorps biotinylés qui peuvent être spécifiques à une protéine ou à une étiquette. Les protéines cibles sont piégées via la valve à bouton MITOMI (III) pour la quantification tandis que les biomatériaux non liés restants sont emportés. Le sens d'écoulement à l'intérieur de l'appareil est indiqué par des flèches vertes. c À gauche, une image d'unités de cellule dans le tableau MITOMI. Les protéines cibles peuvent être immobilisées dans la chambre à protéines et quantifiées de plusieurs manières (illustrées à droite) : i) Un exemple d'une protéine cible portant une étiquette fluorescente (par exemple, GFP) pour la détection (voir étiquette rougeoyante verte) et une non- étiquette fluorescente pour l'immobilisation ; ii) Une protéine cible marquée avec GFP pour l'immobilisation (par des anticorps anti-GFP) et la détection ; iii) La protéine cible n'est pas étiquetée. La détection est basée sur la lysine fluorescente (Lys) incorporée lors de la traduction in vitro. L'immobilisation se fait via des anticorps spécifiques aux protéines. iv) La protéine cible est immobilisée via des anticorps spécifiques à une étiquette ou à une protéine et détectée par immunofluorescence via des anticorps spécifiques à une étiquette couplés à un fluorophore. Dans l'ensemble, l'immobilisation sur puce des protéines cibles repose sur des anticorps biotinylés. L'immobilisation via des anticorps non biotinylés est possible si la chimie de surface comprend des IgG biotinylées.

Comme les tests de dégradation classiques, les protéines cibles pour les analyses de pDOC sont traduites in vitro (IVT) à l'aide d'un lysat de réticulocytes de lapin qui permet un repliement correct et des modifications post-traductionnelles (PTM). Les produits IVT sont immobilisés sur la surface en verre de la puce via une liaison biotine-avidine. A cet effet, des anticorps biotinylés spécifiques sont appliqués sous la valve à bouton. Après l'extraction de la protéine cible, le matériau non lié, tel que le lysat de réticulocytes et l'extrait cellulaire, est éliminé par lavage. Ensuite, toute la puce est passivée par du PEG-Biotine, à l'exception de la zone sous le bouton (Fig. 1b). Les protéines cibles liées sont quantifiées par fluorimétrie. Pour plus de détails, consultez nos publications précédentes25,26,34.

Le dispositif est compatible avec plusieurs stratégies de chimie de surface et configurations expérimentales possibles (illustrées à la Fig. 1c) : 1) La protéine cible est marquée aux extrémités N' et C'. Une étiquette est utilisée pour l'immobilisation via des anticorps biotinylés spécifiques à l'étiquette et la seconde étiquette est une protéine fluorescente (par exemple, GFP), qui est utilisée pour la détection. 2) Une protéine fluorescente est utilisée à la fois pour l'immobilisation et la détection. 3) La protéine cible est traduite dans un lysat contenant de la lysine fluorescente (green-Lys) et immobilisée par des anticorps spécifiques de la protéine. 4) La protéine cible est double étiquetée. Ici, cependant, une étiquette est utilisée pour l'immobilisation tandis que la seconde étiquette est immunodétectable par l'anticorps fluorescent. Il est important de noter que l'immobilisation peut être effectuée avec des anticorps non biotinylés si la chimie de surface comprend également des anti-IgG biotinylés. Cette flexibilité de l'immobilisation et de la quantification des protéines simplifie l'optimisation des tests en fonction des besoins et des limites spécifiques, ainsi que de la polyvalence globale de la plate-forme.

Conceptuellement, l'analyse de la dégradation des protéines par pDOC est directe, simple et rapide ; la détection du signal est basée sur la quantification in situ, évitant ainsi l'électrophorèse sur gel et toute autre procédure liée au gel, par exemple : fixation, séchage, autoradiographie ou immunotransfert, et exposition. Notre premier objectif était d'examiner si la sensibilité au signal et la gamme dynamique de pDOC permettent une quantification temporelle des produits IVT dont la dégradation dans les extraits acellulaires a été dosée en tube, c'est-à-dire hors puce. Comme preuve de concept, nous avons utilisé des extraits mitotiques de cellules HEK293 qui sont bloquées dans un état de type anaphase en raison de niveaux élevés de cycline-B1 non dégradable. Ce système acellulaire mitotique, ci-après dénommé NDB, récapitule la protéolyse médiée par APC/CCdc20 des protéines du cycle cellulaire Securin et Geminin17,35. Les essais de dégradation conventionnels de Flag-Securin-GFP et Flag-Geminin-GFP (produits IVT) radiomarqués dans des extraits mitotiques de NDB sont illustrés à la Fig. 2a (voir également Fig. S1). Des expériences de contrôle avec des variants mutants non dégradables (Geminin ∆27 et Securin ∆64) démontrent la spécificité du test. Les produits IVT non radioactifs équivalents ont été dosés d'une manière similaire. Tout d'abord, nous avons effectué un test au point final (Fig. 2b). Après 60 minutes d'incubation avec des extraits mitotiques NDB, les échantillons de réaction ont été chargés sur pDOC via des canaux séparés et scannés pour la fluorescence GFP. Les réactions témoins, dans lesquelles les produits IVT ont été incubés dans du PBS, nous ont permis de normaliser le niveau de chaque protéine cible à t60 min (rapport extraits/PBS) et d'estimer les signaux de fond. Dans l'ensemble, la détection sur puce démontre une forte réduction du niveau de géminine et de sécurine après incubation dans des extraits mitotiques NDB, tandis que les variantes non dégradables sont restées stables, présentant environ 80 % des signaux GFP de contrôle dans du PBS. À ce stade, nous avons noté que les signaux de fond du lysat de réticulocytes, des extraits cellulaires et de l'immobilisation non spécifique étaient mineurs (Fig. S2).

a Dégradation en fonction du temps de Flag-Securin-GFP, Flag-Geminin-GFP marqués au 35S et de leurs variantes non dégradables (∆64 et ∆27, respectivement) dans des extraits mitotiques NDB (20 µl) additionnés d'E-mix et d'ubiquitine . La protéolyse dépendante du temps a été résolue par SDS-PAGE et autoradiographie. b Des dosages équivalents ont été effectués avec des produits IVT non radioactifs. Les protéines cibles ont été incubées 1 h dans une solution réactionnelle contenant soit des extraits, soit du PBS (témoin). Des aliquotes de chaque mélange réactionnel (5 µl) ont ensuite été chargées directement sur une puce via des canaux séparés, chacun contenant des dizaines d'unités cellulaires. Les protéines cibles ont été immobilisées dans des chambres à protéines via un anticorps anti-GFP biotinylé. La balise GFP a également été utilisée pour la quantification. Les signaux GFP ont été calculés à partir de 14 à 19 unités cellulaires par protéine cible par condition de réaction (extraits vs PBS). Les diagrammes en boîte représentent les rapports des signaux GFP (extraits/PBS) à t60 min. La moyenne (x) et la médiane (-) sont indiquées. *valeur p < 0,001. Des données brutes représentatives décrivant la détection sur puce des quatre protéines cibles sont présentées. c La dégradation du variant Flag-Securin-GFP a été analysée dans un tube comme décrit dans B. Ici, cependant, des aliquotes ont été congelées toutes les 15 minutes. Des échantillons accélérés ont ensuite été chargés sur la puce pour analyse. Les protéines cibles ont été immobilisées dans des chambres à protéines via des anticorps anti-GFP et quantifiées sur la base de la fluorescence GFP. Les dégradations en fonction du temps de wt par rapport au mutant Securin ont été quantifiées sur la base du signal 35S (analyse standard ; n = 3] et de la fluorescence GFP (analyse sur puce). Les tracés représentent les signaux moyens et les barres d'erreur standard. Les signaux moyens ont été calculés à partir de 26 cellules et normalisé entre les valeurs max (1, t0) et min (0, t60 min), permettant une comparaison correcte entre deux méthodes de détection très différentes. Des barres d'erreur sont affichées. d Expérience équivalente à (c) réalisée avec Flag-Geminin-GFP , sauf que l'immobilisation était basée sur des anticorps anti-Flag n = 30–40 unités cellulaires.

Ensuite, nous avons testé si pDOC peut être utilisé pour obtenir des informations cinétiques fiables sur la dégradation des protéines. Flag-Securin-GFP et Flag-Geminin-GFP ont été incubés dans des extraits mitotiques NDB pendant 60 min, et les échantillons de réaction ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide toutes les 15 min. Après décongélation rapide, des échantillons représentant cinq points dans le temps ont été chargés sur la puce pour la quantification du signal. Des analyses comparables ont été réalisées par SDS-PAGE et autoradiographie. Des variants Flag-Securin∆64-GFP et Flag-Geminin∆27-GFP non dégradables ont également été dosés par autoradiographie pour le contrôle. Compte tenu des grandes différences entre les deux méthodes de détection, les signaux GFP et d'autoradiographie ont été normalisés entre 0 et 1, ce qui signifie que le signal à t60 min a été soustrait de tous les autres points dans le temps. Les valeurs résultantes ont été normalisées au signal max à t0 et tracées. Comme le montrent les figures 2c, d, l'analyse sur puce par pDOC et l'analyse hors puce par autoradiographie SDS-PAGE ont montré des schémas de dégradation presque identiques de Flag-Securin-GFP et Flag-Geminin-GFP. Notez que les cocktails réactionnels contenaient 1 μl d'IVT, 20 μl d'extraits et 2 μl d'ubiquitine/E. mélanger la solution, en suivant notre protocole standard17,27,36. Pour chaque point de temps, 5 μl de mélanges réactionnels ont été coulés pendant une période de 5 min à travers des chambres à protéines avec des vannes à bouton MITOMI ouvertes, permettant l'immobilisation de la protéine cible, tandis que les vannes du col étaient fermées. Ce protocole de chargement a permis une visualisation claire de la protéine cible sans se soucier de la saturation du signal (Fig. S3). Nous avons conclu que pDOC facilite les analyses à la fois du point final et de l'évolution temporelle de la dégradation des protéines in vitro. Fait important, Flag-Securin-GFP a été immobilisé dans des chambres protéiques via des anticorps anti-GFP biotinylés plutôt que des anticorps anti-Flag. Ce faisant, nous avons effectivement démontré que la GFP peut servir à la fois à l'immobilisation et à la détection, éliminant ainsi le besoin de deux balises. Dans l'ensemble, nous pensons que GFP est une étiquette optimale pour la détection de signal sur puce.

La fusion d'une protéine fluorescente à une protéine cible, cependant, peut déformer le repliement des protéines de manière à limiter efficacement la protéolyse. Ainsi, la quantification des protéines indépendante des étiquettes protéiques fluorescentes peut, dans certains cas, être importante. Dans ce contexte, la flexibilité de pDOC est particulièrement avantageuse. La figure 3a représente deux configurations alternatives par lesquelles la dégradation de Securin pourrait être enregistrée sur puce : 1) détection directe par green-Lys ; et 2) détection indirecte par immunofluorescence in situ. Le taux de sécurine a été mesuré à t0 et t60 min. Les deux approches étaient informatives, révélant la dégradation de Securin dans l'environnement mitotique NDB, sans équivoque. En ce qui concerne la détection directe, il convient de noter que les produits IVT marqués avec GFP sont, dans l'ensemble, plus brillants que les protéines équivalentes marquées avec green-Lys. De facto, cependant, cette expérience démontre que la green-Lys intégrée ne bloque pas la protéolyse qui est basée sur la modification chimique des résidus Lys37. La détection indirecte par immunofluorescence repose intrinsèquement sur deux étiquettes (une seule étiquette ne peut pas être utilisée à la fois pour l'immunomarquage et l'immobilisation) et nécessite une incubation supplémentaire de 30 min. Cependant, la petite taille des étiquettes immunodétectables standard minimise le risque de mauvais repliement des protéines et le signal lumineux émis par les fluorophores commerciaux auxquels les anticorps sont couplés est avantageux.

a La dégradation de Flag-Securin-Myc, Flag-Securin-GFP et Green-Lys-labeled Flag-Securin (produits IVT) dans des extraits mitotiques NDB a été dosée dans un tube pendant 1 h. L'analyse sur puce a été effectuée de plusieurs façons : 1) Flag-Securin-Myc a été immobilisé par des anticorps anti-Myc et détecté par des anticorps conjugués anti-Flag Cy5 ; 2) Flag-Securin-GFP a été immobilisé et détecté via l'étiquette GFP ; et 3) la Flag-Securin marquée au Green-Lys a été immobilisée via des anticorps anti-Flag et détectée par le signal Green-Lys. Les anticorps anti-Myc/Flag/GFP sont biotinylés. Les tracés et les données brutes représentent les niveaux de protéines à t0 par rapport à t60 min. Les signaux sont normalisés aux valeurs maximales à t0. Les valeurs moyennes et les barres d'erreur standard sont affichées ; n = 20–40 unités cellulaires. *valeur p < 0,001. b La dégradation de p27 marqué au Green-Lys (non étiqueté) et de Flag-Securin-GFP a été dosée dans des extraits en phase S et analysée par pDOC. p27 a été immobilisé via des IgG anti-souris biotinylées et des anticorps anti-p27. Le signal Green-Lys a été utilisé pour la détection. Flag-Securin-GFP a été immobilisé via des anticorps anti-Flag biotinylés. Après incubation avec des extraits cellulaires, les niveaux de protéines ont été quantifiés par fluorescence GFP ou Green-Lys à des intervalles de 15 minutes. Les tracés représentent les valeurs moyennes et d'erreur standard normalisées au signal max à t0. n = 20 (p27) et 10 unités cellulaires (Securin).

La polyvalence de pDOC a été démontrée en utilisant p27 sans étiquette (Fig. 3b). La dégradation de p27 est médiée par la SCFSkp2 E3 ligase, plutôt que par APC/C, et est orchestrée avec la phase de synthèse d'ADN (S) du cycle cellulaire38. La dégradation de p27 a été dosée dans des extraits de cellules HeLa S3 synchrones en phase S et analysée par pDOC. La protéine a été immobilisée via des anticorps anti-p27 et anti-IgG biotinylés, et détectée par green-Lys. L'analyse par pDOC a révélé l'instabilité stéréotypée de p27 dans les extraits en phase S (Fig. 3b). Le schéma de dégradation ressemblait à celui mesuré par autoradiographie (Fig. S4). Ainsi, pDOC peut être utilisé pour des essais de dégradation de protéines non marquées. De plus, le procédé est spécifique et non limité à un certain type de systèmes sans cellules.

Les avantages des tests de dégradation basés sur l'autoradiographie comprennent un rapport signal sur bruit élevé, une spécificité élevée du signal et la linéarité du test. Cependant, cela ne vient pas sans coût. Premièrement, l'isotope 35S est un réactif de courte durée avec une demi-vie d'environ 3 mois. Deuxièmement, sur le gel, le signal est étalé sur un puits de 4 à 5 mm de largeur (gel standard à 10 puits). Troisièmement, dans un test de dégradation standard, 1 à 2 μl de produit IVT sont dilués dans 20 à 30 μl d'extraits cellulaires dont la concentration en protéines est d'environ 20 à 25 mg/ml. Ainsi, la quantité d'IVT chargée par piste est limitée par la capacité de séparation maximale du gel. En règle générale, nous chargeons 4 à 5 μl de mélange réactionnel dans un puits d'un mini-gel standard à 10 puits de 1 mm d'épaisseur. Quatrièmement, la traduction in vitro est difficile pour les grosses protéines en raison de la processivité des ribosomes. Ainsi, bien que les grandes protéines incorporent plus de méthionine/cystéine radiomarquées par rapport aux petites protéines, le signal global de la protéine pleine longueur peut être peu pratique pour une quantification fiable. Cinquièmement, le temps d'exposition nécessaire pour un signal de haute qualité est généralement compris entre 12 et 24 h. Notez que les points 2 à 4 mentionnés ci-dessus sont également pertinents lorsque la dégradation des protéines est dosée par SDS-PAGE et immunotransfert. Comme pour le point 5, l'immunotransfert ne nécessite pas de longues expositions. Pourtant, le temps d'incubation global avec les anticorps est long. En outre, les produits IVT dans les tests basés sur l'immunoblot doivent être étiquetés afin d'être distingués des protéines endogènes dans les extraits. À ce stade, il est important de noter que si la dégradation est dosée par autoradiographie ou immunotransfert, l'expression informative des produits IVT doit être validée au préalable, en soi, une procédure d'une journée. La validation équivalente par pDOC est instantanée.

Sur puce, les signaux de fluorescence de Flag-Securin-GFP à t60 min étaient supérieurs au niveau de fond et plus perceptibles par rapport à l'autoradiographie (Figs. 2a et 3a). Pourtant, lorsque le signal à t60 min a été soustrait de tous les autres points dans le temps, les schémas de dégradation globaux de Flag-Securin-GFP, tels que révélés par pDOC et l'autoradiographie, étaient similaires (Fig. 2c, d). Cette observation suggère que pDOC détecte les résidus protéiques encore présents dans le mélange réactionnel après 60 min d'incubation, et qui sont à peine détectés par autoradiographie, voire pas du tout. Ainsi, on peut affirmer que la sensibilité de pDOC dépasse celle de l'autoradiographie conventionnelle, et si tel est le cas, pDOC facilite non seulement les essais de dégradation in vitro, mais réduit également considérablement la consommation de réactifs et le coût par essai. Pour tester cela, nous avons dilué Flag-Securin-GFP dans du lysat de réticulocytes 4 et 10 fois et incubé le substrat dans des extraits mitotiques NDB pendant 1 h, tout en maintenant le rapport de volume original de lysat de réticulocytes/extrait de 1/20 (µl). Les échantillons de point temporel ont été analysés par pDOC (basé sur la fluorescence GFP). Expériences équivalentes réalisées en parallèle avec Flag-Securin-GFP marqué au 35S, suivant le dosage conventionnel (Figs. 4 et S5). Pour clarifier, les substrats radiomarqués et non radiomarqués ont été exprimés simultanément à partir du même mélange de solution TNT®/ADN. De plus, des tests de dégradation ont été effectués un jour après la livraison de la solution 35S-Met/35S-Cys à notre laboratoire (~ 1175 Ci/mmol), et les gels ont été exposés à un écran phosphorescent pendant la nuit. Pourtant, chaque fois que le substrat IVT était dilué, le signal obtenu par autoradiographie était inférieur à toute norme acceptable, même à t0, et diminuait à des niveaux à peine ou indétectables après 15 minutes d'incubation (Figs. 4a et S5). À l'inverse, les analyses par pDOC étaient informatives dans les trois conditions (Fig. 4b). Nous avons pu détecter des signaux authentiques de Flag-Securin-GFP dilués 4 et 10 fois à t0 ainsi qu'à t60 min, enregistrant la dynamique complète de la protéine dans des extraits mitotiques NDB. Sur une note plus pratique, nous avons effectivement démontré que la dégradation des protéines peut être analysée avec 0,1 µl de produit IVT et 2 µl d'extraits cellulaires, économisant ainsi 90 % des réactifs. Cette caractéristique est particulièrement précieuse dans les dosages qui reposent sur un matériel biologique limité, par exemple, des extraits de cellules primaires et des échantillons de tissus normaux/pathologiques.

un test de dégradation en fonction du temps de Flag-Securin-GFP marqué au 35S dans des extraits mitotiques NDB. Les dosages ont été effectués avec un produit IVT non dilué (100 %) ou après une dilution 4x/10x dans un lysat de réticulocytes (25 et 10 %, respectivement). Dans tous les essais, 1 ul de substrat a été incubé dans 20 ul d'extraits cellulaires. Les échantillons ont été congelés instantanément à des intervalles de 20 minutes et analysés par SDS-PAGE et autoradiographie. b Tests de dégradation équivalents réalisés avec Flag-Securin-GFP non radioactif. Des échantillons ponctuels ont été chargés sur la puce pour immobilisation (via un anticorps anti-GFP biotinylé) et détection (fluorescence GFP). Les tracés résument les données de trois expériences, 15 à 20 unités cellulaires par expérience. Les valeurs de moyenne et d'erreur standard normalisées sont indiquées (à gauche). Les données brutes représentatives sont présentées à droite.

pDOC dévoile une quantité rémanente de Flag-Securin-GFP qui ne pouvait pas être visualisée par des méthodes conventionnelles. Fait intéressant, alors que le schéma de dégradation global de Flag-Securin-GFP dans les trois conditions était similaire, nous avons remarqué un retard systématique dans la dégradation de Flag-Securin-GFP lorsque la concentration de substrat était réduite. Cette observation n'a pas été identifiée auparavant dans notre laboratoire et pourrait être attribuée à des étapes limitant la vitesse tout au long du processus d'ubiquitination/dégradation de Securin, et peut-être des substrats APC/C en général39,40. Notez que la concentration estimée de Flag-Securin-GFP dans le mélange réactionnel était de 17 nM (avant dilution supplémentaire dans le lysat de réticulocytes; Fig. S6).

Jusqu'à présent, nous avons démontré la capacité de pDOC à faciliter l'analyse des réactions de dégradation des protéines, qui étaient réalisées en tube, c'est-à-dire hors puce (Figs. 2–4). Techniquement, cependant, les vannes à col et à bouton MITOMI permettent un mélange régulé dans le temps entre la protéine cible et les extraits acellulaires au sein de chaque unité cellulaire. Plus précisément, le chargement et l'immobilisation des protéines cibles sont effectués avec des valves à col fermé. Une fois que les protéines cibles sont piégées sous les boutons MITOMI fermés, les extraits cellulaires peuvent être transportés dans la puce. Cette étape est réalisée avec des vannes à col ouvert, permettant aux extraits cellulaires d'atteindre la chambre I. Les extraits cellulaires peuvent ensuite être piégés dans la chambre I, notée ici comme "chambre d'extraction", en refermant la vanne à col, et tous les matériaux restants sont ensuite emportés. La réaction de dégradation commence (t0) avec l'ouverture des vannes à col et à bouton MITOMI. Les extraits cellulaires diffusent dans la chambre à protéines et atteignent la protéine cible exposée (illustrée à la Fig. 5a). Potentiellement, ce pipeline permet un test complet sur puce pour la dégradation des protéines. La motivation d'un test sur puce est triple : 1) économie de réactif et coût par test. En effet, 5 µl d'extraits cellulaires suffisent pour remplir mille unités cellulaires ; 2) analyse de la dégradation des protéines en temps réel. 3) un débit plus élevé, en particulier si les protéines cibles sont exprimées sur puce, comme cela a été démontré précédemment25,26,27. Le défi, cependant, est la capacité de dégradation limitée de <1 nl d'extraits par unité cellulaire, qui n'a jamais été testée sur aucune plate-forme. Nous avons décidé de tester la faisabilité de la dégradation des protéines sur puce. À cette fin, des variantes wt et non dégradables de Flag-Securin-GFP ainsi que de Flag-p27-GFP (produits IVT) ont été chargées sur la puce (par des canaux séparés) et capturées dans des chambres à protéines sous la valve à bouton MITOMI via biotinylated anticorps anti-GFP. Après lavage, les extraits mitotiques NDB ont été chargés dans la chambre d'extraction et piégés en fermant la valve du col. Les matériaux non piégés ont été emportés. L'appareil a été chauffé à 30 ° C et scanné pour obtenir des signaux de t0. L'ouverture du col et la valve à bouton MITOMI ont déclenché simultanément des réactions de dégradation dans toutes les unités cellulaires (Fig. 5a, b), et la puce a été scannée à des intervalles de temps de 15 min. Alors que le signal fluorescent de la Securin non dégradable, p27, ainsi que de la GFP elle-même (Fig. S7), est resté stable dans les extraits mitotiques NDB tout au long de l'expérience, le signal de Flag-Securin-GFP a diminué avec le temps (Fig. 5c), révélant la protéolyse régulée de cette protéine en milieu mitotique.

a, b Illustration schématique du test de dégradation complet sur puce par pDOC. Les produits protéiques IVT sont immobilisés à la surface de la «chambre protéique» via un anticorps biotinylé anti-GFP (voir plus d'informations sur la figure 1). La fermeture de la valve à bouton MITOMI emprisonne la protéine. Tous les restes sont lavés avec du PBS. L'expression et l'immobilisation correctes des protéines cibles sont validées par balayage. Ensuite, les extraits acellulaires sont chargés dans la chambre d'extraction et piégés en fermant la valve du col. La réaction commence par l'ouverture du col et des valves à bouton MITOMI, ce qui permet la diffusion d'extraits cellulaires dans la « chambre à protéines » et le mélange avec la protéine cible. La puce est placée sur une plaque chauffante à 30 ° C et scannée à des intervalles de 15 min pour fournir des informations cinétiques en temps réel. c Les produits Securin et p27 IVT marqués GFP ont été immobilisés via un anticorps anti-GFP biotinylé. Les chambres d'extraction ont ensuite été remplies d'extraits mitotiques NDB qui soutiennent l'ubiquitination de Securin, mais pas de sa variante non dégradable (Δ64) et p27 (contrôle négatif validant la spécificité du test). La dégradation des protéines a été dosée pendant 1 h au cours de laquelle la puce a été scannée cinq fois. Le graphique représente les signaux GFP moyens normalisés à t0 et les barres d'erreur standard ; n = 14–30 unités cellulaires. Les données brutes représentatives pour p27 et Securin sont présentées à droite.

La lysine est le principal site d'ubiquitination et des dizaines d'autres PTM qui peuvent réguler la dégradation des protéines de manière moins directe. Nous avons tiré parti de la capacité de multiplexage de pDOC et testé la contribution des résidus de lysine à la dégradation globale de Geminin dans un environnement mitotique. Les éléments cis régulant la dégradation de la géminine sont situés à l'extrémité N-terminale de la protéine. En fait, la protéine fluorescente monomère Azami-Green (mAG) attachée aux 110 premiers acides aminés de Geminin (mAG-Geminin) est un marqueur bien connu de l'activité APC/C dans les cellules31,41. Nous avons construit un mAG-Geminin étiqueté Flag, ci-après appelé "Geminin-degron", et généré un panel de variants mutants dans lesquels des résidus de lysine (K) uniques ont été remplacés par de l'alanine (A). Une variante non dégradable, dans laquelle la séquence de la boîte de destruction 23RxxL26,42, a été remplacée par GxxV (code d'acide aminé unique), a également été construite (Fig. 6a). La dégradation de toutes les variantes dans les extraits mitotiques NDB a d'abord été testée sur puce (voir Fig. 5 pour plus de détails techniques). Les produits IVT ont été immobilisés sur la puce via des anticorps anti-Flag biotinylés et quantifiés par fluorescence mAG à t0 et t60 min. Le rapport de signal entre ces points dans le temps a été normalisé entre 0 et 1, c'est-à-dire le rapport calculé pour wt (0) et non dégradable (1) Geminin-degrons (Fig. 6b). Ensuite, un sous-ensemble de variants mutants a été soumis à des réactions de dégradation hors puce suivies d'une analyse sur puce (Fig. 6c ; voir Fig. 2 pour plus de détails techniques). Une tendance de dégradation similaire a été observée dans les deux tests de point final (Fig. 6d). Remarque, la même stratégie utilisée pour la quantification et la normalisation du signal. Il est important de noter que les deux tests ont montré une capacité de dégradation limitée du variant K50A dans les extraits mitotiques NDB. La stabilité partielle de la variante K50A a été validée par une analyse de dégradation en fonction du temps (Fig. 6e). À cette fin, les réactions de dégradation en tube ont été échantillonnées toutes les 20 min et analysées sur puce. Fait intéressant, la dégradation limitée ou variante K50A n'a pas pu être détectée par SDS-PAGE et autoradiographie (Figs. 6f et S8). Cet écart peut s'expliquer par la sensibilité différentielle des deux méthodes et la capacité de pDOC à détecter des quantités moindres de substrat (Fig. 4). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que la lysine 50 contribue à la dégradation de Geminin. À l'heure actuelle, il n'est pas clair si la lysine 50 est polyubiquitinée. Mais si nous devions suivre ce modèle, l'ubiquitination de Geminin n'est clairement pas limitée à la lysine 50, sinon le variant K50A serait resté stable dans les extraits mitotiques NDB. Plus généralement, les données présentées sur la figure 6 démontrent une analyse systématique de la dégradation des protéines par pDOC.

a Une illustration de Geminin-degron étiquetée avec Flag et mAG. Les lysines et l'élément central (RxxL) de la boîte de destruction (boîte D) sont indiqués par un code d'acides aminés à une seule lettre. Des variants mutants ont été générés en remplaçant des résidus de lysine uniques par de l'alanine. Le mutant D-box (DBM) Geminin porte la glycine et la valine aux positions 23 et 26, respectivement. b Analyse de la dégradation du point final des variants Geminin-degron sur puce. La ligne pointillée représente une valeur seuil (c'est-à-dire quatre écarts-types de wt Geminin-degron à t0) au-dessus de laquelle les variantes ont été signalées pour d'autres analyses. c Analyse des dégradations au point final de certaines variantes de Geminin-degron. Les réactions de dégradation ont été réalisées en tube et les niveaux de protéines ont été quantifiés sur puce (voir Fig. 2 pour les détails techniques). b, c Les niveaux normalisés de variants Geminin-degron à t60 min sont tracés. n = 12–38 (b) et 21–57 (c) unités cellulaires. d Une corrélation linéaire entre les données représentées en B et C. Les valeurs moyennes et d'erreur standard sont indiquées. e, f Les dégradations dépendant du temps des variants de Geminin-degron (dans le tube) ont été analysées sur puce (e ; n = 16-25 unités cellulaires) par SDS-PAGE et autoradiographie (f ; les données brutes représentatives sont présentées à gauche ; n = 3). Toutes les réactions de dégradation sont dans des extraits mitotiques NDB.

pDOC est une plateforme de laboratoire sur puce conçue pour faciliter et simplifier la découverte et l'analyse de la dégradation des protéines dans des contextes physiologiquement pertinents. La puce accueille des centaines de microchambres dans lesquelles la dégradation des protéines peut être dosée rapidement et simultanément. Il est important de souligner, cependant, que la motivation et le besoin de pDOC transcendent de loin son potentiel à haut débit : 1) les analyses peuvent être effectuées avec des quantités considérablement inférieures de réactifs par rapport aux tests conventionnels. Cette dernière caractéristique est particulièrement cruciale pour les extraits acellulaires dont la production peut être un goulot d'étranglement en termes de temps, d'activité et de quantité, par exemple, les extraits cellulaires dont l'origine est de précieux échantillons de tissus normaux/malins à des fins de recherche biomédicale globale/personnelle/ Diagnostique; 2) La détection du signal est basée sur la quantification in situ du signal fluorescent. La méthode est indépendante des matières radioactives contaminantes et pourtant, avec une sensibilité qui surpasse les dosages traditionnels. Une comparaison entre pDOC et le test de dégradation conventionnel est illustrée à la Fig. 7) la flexibilité de pDOC est substantielle ; la plate-forme facilite presque toutes les conceptions expérimentales possibles. Tout d'abord, les protéines étiquetées et non étiquetées peuvent être dosées, avec une détection basée sur l'incorporation de Green-Lys, de protéines fluorescentes ou d'étiquettes immunodétectables. Deuxièmement, pDOC peut être utilisé comme colonne microfluidique intégrée pour des analyses instantanées de réactions de dégradation hors puce à faible volume (Figs. 2–3). L'intégration de deux modules de chargement permet le chargement simultané de dizaines de solutions de réaction sur la puce. Les protéines cibles sont purifiées et concentrées sur la chambre protéique des unités cellulaires, permettant la détection sur puce de la dégradation hors puce en quelques minutes à 1 h (selon le protocole de détection). Alternativement, la dégradation des protéines peut être dosée entièrement sur puce et en temps réel. Cette caractéristique de pDOC est importante non seulement en raison de la capacité de tester la dégradation des protéines dans un volume inférieur au nanolitre, mais en raison de la compatibilité inhérente des dispositifs basés sur MITOMI avec la traduction in vitro sur puce24,25,27. En exprimant un réseau de protéines sur puce, on peut multiplexer des protéines cibles de dizaines à des centaines, augmentant considérablement le débit. L'inconvénient de l'expression sur puce est que l'assemblage du dispositif avec la puce à ADN n'est pas anodin et doit actuellement être réalisé par des experts dans des laboratoires spécialisés. Dans l'ensemble, la nature multiplex de pDOC est bilatérale : une solution de réaction peut être appliquée à des dizaines ou des centaines de protéines différentes, ou une ou plusieurs protéines peuvent être testées pour la dégradation dans plusieurs conditions physiochimiques, simultanément. Cette qualité est pertinente pour l'analyse des réactions de dégradation sur puce et hors puce.

Le but de toutes les méthodes est de doser la dégradation des protéines des produits protéiques IVT dans un mélange réactionnel comprenant des extraits acellulaires, de l'ubiquitine recombinante et un mélange de régénération d'énergie (E. mix). Le dosage standard (tuyau rouge) est généralement radioactif. Un produit IVT marqué au 35S (1–2 µl) est mélangé avec 20–50 µl de mélange réactionnel et incubé pendant 30–90 min. À chaque instant, une aliquote (~ 5 µl) du mélange réactionnel est récoltée. Les échantillons sont dénaturés et résolus par SDS-PAGE. Après séchage, le gel est exposé à un écran luminophore. Habituellement, un signal satisfaisant est obtenu pendant la nuit (ON). Des expositions plus longues (24 à 72 h) sont souvent nécessaires lorsque le signal radioactif est faible pour diverses raisons. pDOC fournit deux tests alternatifs (canalisations bleues), tous deux avec des avantages. Stratégie I : Les réactions de dégradation sont effectuées hors puce. La protéine cible est soit fusionnée à une étiquette standard (par exemple, GFP, Flag, Myc, etc.) soit traduite en présence de Green-Lys. Les échantillons de point temporel sont soit chargés sur la puce de manière séquentielle, soit bouillis/congelés d'abord, puis chargés simultanément. La protéine cible est immobilisée par des anticorps de surface spécifiques à l'étiquette / à la protéine, tous les autres matériaux sont éliminés et la quantification est effectuée par l'une des stratégies détaillées sur la figure 1c presque instantanément. Stratégie II : Ici, les protéines cibles et les extraits cellulaires sont chargés successivement sur la puce et occupent des chambres séparées au sein de chaque unité cellulaire. Le mélange des deux martiaux déclenche la réaction. Le balayage accéléré fournit des informations cinétiques. Alors que la stratégie I est plus simple, la stratégie II est plus optimale pour les expériences à haut débit. Les deux stratégies sur puce économisent les réactifs et sont considérablement plus courtes que le test standard.

La protéolyse médiée par l'ubiquitine est régulièrement testée dans des centaines de laboratoires à travers le monde. De plus, il s'agit d'une voie de signalisation majeure pour la thérapie (par exemple Velcade®) et la conception de médicaments (par exemple, Nurix Therapeutics). Nous avons conçu pDOC pour faciliter et simplifier les analyses in vitro de la dégradation des protéines dans des environnements quasicellulaires. La méthode est rapide, sensible, économe en réactifs et adaptée aux études à faible et à haut débit. Il convient également de noter qu'une automatisation complète de la plate-forme est prévisible. Nous pensons donc que pDOC est un outil précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle sur la dégradation ciblée des protéines.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Les données sources pour les figures et les figures supplémentaires sont fournies dans deux fichiers.xlsx : données supplémentaires 1 (figures) et données supplémentaires 2 (figures supplémentaires).

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Nous remercions les membres du laboratoire Gerber et Tzur pour le partage des réactifs. Le laboratoire Tzur est soutenu par la subvention no. 2038/19. Le laboratoire Gerber est soutenu par la subvention européenne Imageomics FET n° 205761.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lev Brio, Danit Wasserman.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Doron Gerber, Amit Tzur.

Faculté des sciences de la vie Mina & Everard Goodman et Institut des nanotechnologies et des matériaux avancés, Université Bar Ilan, Ramat Gan, Israël

Lev Brio, Danit Wasserman, Efrat Michaely-Barbiro, Gal Barazany-Gal, Doron Gerber et Amit Tzur

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Recherche conçue par LB, DW, EMB, DG et AT ; LB, DW et EMB ont effectué des recherches ; LB, DW, EMB, GBG, DG et AT ont apporté de nouveaux réactifs ou outils analytiques ; LB, DW et EMB ont analysé les données ; DW, LB, EMB, DG et AT ont rédigé l'article.

Correspondance à Doron Gerber ou Amit Tzur.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Tous les auteurs ont accepté tous les contenus du manuscrit, la liste des auteurs et son ordre et les déclarations de contribution des auteurs.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong.

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Réimpressions et autorisations

Brio, L., Wasserman, D., Michaely-Barbiro, E. et al. La microfluidique d'affinité permet une analyse à haut débit de la dégradation des protéines dans des extraits acellulaires. Commun Biol 5, 1147 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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Reçu : 27 août 2021

Accepté : 12 octobre 2022

Publié: 28 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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