Profilage des protéines de surface de la prostate

Communications Biology volume 5, Article number: 1402 (2022) Citer cet article

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont des médiateurs de la communication intercellulaire et une classe prometteuse de biomarqueurs. Les protéines de surface des véhicules électriques jouent un rôle décisif dans l'établissement d'une connexion avec les cellules réceptrices et sont des cibles potentielles pour les tests de diagnostic. L'analyse des protéines de surface peut ainsi à la fois éclairer les fonctions biologiques des véhicules électriques et aider à identifier des biomarqueurs potentiels. Nous avons développé une stratégie combinant la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et les tests de ligature de proximité (PLA) pour d'abord identifier puis valider les protéines de surface découvertes sur les véhicules électriques. Nous avons appliqué notre flux de travail pour étudier les protéines de surface des petits véhicules électriques trouvés dans le liquide séminal (SF-sEV). Nous avons identifié 1 014 protéines de surface et vérifié la présence d'un sous-ensemble de celles-ci à la surface des SF-sEV. Notre travail démontre une stratégie générale pour l'analyse approfondie des protéines de surface des véhicules électriques à travers les patients et les conditions pathologiques, passant d'un dépistage impartial par HRMS à des analyses ciblées ultra-sensibles via PLA.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules bicouches lipidiques sécrétées par la plupart des cellules. Il existe trois principaux sous-groupes d'EV, qui sont classés en fonction de leur taille, de leur biogenèse et de leur densité : (i) les exosomes, (ii) les microvésicules et (iii) les corps apoptotiques. Les exosomes sont de petits EV (sEV) d'une taille comprise entre 30 et 150 nm, qui sont générés par le bourgeonnement vers l'intérieur des endosomes, qui conduisent à la production de corps multivésiculaires (MVB). Les MVB fusionnent finalement avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu en sEV dans la matrice extracellulaire ainsi que dans les fluides corporels, où il a été démontré que les sEV jouent un rôle essentiel dans la communication intercellulaire1,2,3,4,5. Les microvésicules d'une taille comprise entre 100 et 800 nm et les corps apoptotiques d'une taille comprise entre 200 nm et 5 μm sont excrétés directement des membranes plasmiques des cellules viables et de celles subissant une mort cellulaire programmée, respectivement6. Les sEV, ainsi que les microvésicules et les corps apoptotiques peuvent assurer le transport intercellulaire pour la livraison de cargaisons moléculaires contenant des protéines, des lipides, des petits ARN et d'autres espèces d'ARN, ainsi que des fragments d'ADN génomique1,7,8.

Des études récentes ont démontré que le contenu des VE diffère selon leur lignée cellulaire et qu'ils reflètent ainsi les cellules dont ils sont issus. L'analyse de la variation dynamique des empreintes digitales sEV peut fournir un moyen précieux pour suivre et surveiller les maladies9,10,11,12,13. Les études moléculaires et les tests actuels axés sur les biomarqueurs circulants évaluent principalement la teneur en ARN et en lipides des sEV circulants, mais il existe également un intérêt croissant pour étudier la composition protéique des sEV3. En particulier, les protéines de surface des VE présentent un grand intérêt en raison de leur rôle dans l'établissement du contact avec les cellules cibles, ce qui peut conduire à leur absorption cellulaire ou à leur fusion avec la membrane plasmique avant la libération de leurs cargaisons moléculaires14.

Les sEV du liquide séminal (SF-sEV), également connus sous le nom de prostasomes, sont sécrétés par la prostate dans le liquide séminal, où l'une de leurs fonctions clés est d'interagir directement et de protéger les spermatozoïdes15,16,17. La fusion des SF-sEV avec la membrane plasmique du sperme est nécessaire pour la régulation de différents aspects de la fonction des spermatozoïdes, tels que la motilité et la capacitation, l'une des dernières étapes de la maturation des spermatozoïdes nécessaires pour acquérir la capacité de fécondation18,19. Les SF-sEV ont également été impliqués dans l'interaction entre les cellules cancéreuses de la prostate et leur microenvironnement20. Ils sont reconnus comme des biomarqueurs potentiels dans l'infertilité masculine21 et le cancer de la prostate22,23, mais on sait peu de choses sur les mécanismes cellulaires conduisant à leur production et les voies moléculaires pilotant les fonctions du SF-sEV.

L'analyse des protéines basée sur la spectrométrie de masse (MS) est un outil efficace et largement utilisé pour caractériser les protéines EVs24,25. Les données générées par la SEP ont contribué au développement de bases de données en ligne, comme ExoCarta (www.exocarta.org)26 et Vesiclepedia (www.microvesicles.org), qui répertorient les protéines présentes dans les VE, y compris les sEV27. Plusieurs techniques biochimiques ont été appliquées pour l'analyse basée sur la SEP des protéines membranaires à faible abondance dans les véhicules électriques28. En particulier, des réactifs non perméables à la membrane pour la dérivatisation chimique, tels que la sulfo-NHS-SS-biotine, ont été mis en œuvre pour étudier à la fois les protéines de surface cellulaire29 et les protéines de surface EV des cellules cancéreuses pancréatiques30 et la lignée de mastocytes HMC-131.

Cependant, les stratégies basées sur la SEP seules ne parviennent pas à établir la localisation et l'orientation correctes des protéines sur les surfaces des véhicules électriques. Par conséquent, d'autres expériences de validation appliquant des méthodes orthogonales32,33 sont souvent nécessaires, telles que des méthodes d'immuno-affinité couplées à la microscopie électronique et à super-résolution34,35,36,37. Généralement, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et d'autres dosages basés sur l'affinité sont utilisés pour détecter des molécules de surface connues sur des véhicules électriques intacts. Néanmoins, ces méthodes ne conviennent pas aux enquêtes larges et multiplex sur les protéines de surface puisque seules deux protéines cibles peuvent être interrogées par essai, et les résultats peuvent être compromis par une liaison non spécifique et une réactivité croisée. Bien que les réseaux d'anticorps aient récemment été appliqués dans différents formats pour la détection de grands ensembles de protéines associées à l'EV38,39,40, en raison du spectre limité de reconnaissance de l'antigène, ils ne sont pas adaptés à la découverte impartiale de protéines EV biologiquement et cliniquement pertinentes, malgré leur capacité de multiplexage et leurs faibles besoins en échantillons.

Dans cette étude, nous avons développé un flux de travail pour la découverte et la validation de protéines de surface EV inconnues en combinant l'analyse MS (HRMS) à haute résolution des protéines de surface dérivées de la biotine avec des tests de ligature de proximité basés sur la cytométrie en flux (Exo-PLA) et/ou tests de ligature de proximité en phase solide (SP-PLA) (Fig. 1). La cytométrie en flux est une technique robuste pour mesurer les marqueurs cellulaires de surface et un outil utilisé régulièrement pour le profilage cellulaire dans la pratique clinique41,42. Cette technique se prête également aux analyses de réseaux de billes43,44. La possibilité de distinguer les sous-populations des VE rend la cytométrie en flux particulièrement attrayante pour l'étude des VEs ; cependant, en raison de leur petite taille et du faible nombre de molécules de surface, les possibilités d'utilisation de la cytométrie en flux conventionnelle restent limitées. L'utilisation d'Exo-PLA, une technologie de détection multicolore et d'amplification du signal, permet de surmonter les limitations de taille et de signal pour l'analyse par cytométrie en flux des sEV. En effet, en profitant de l'amplification locale du signal via l'amplification en cercle roulant (RCA), les sEV individuels deviennent détectables bien au-dessus du seuil de cytométrie en flux. En utilisant différents liants d'affinité, tels que des anticorps, et plusieurs colorants fluorescents, différentes sous-populations de sEV peuvent ensuite être visualisées et dénombrées45,46. SP-PLA repose sur la reconnaissance de la cible par des ensembles combinés de trois anticorps, avec des lectures via PCR en temps réel, ce qui offre une excellente sensibilité et spécificité pour la détection des sEV en solution23.

a Les SEV ont été isolés des fluides séminaux humains et des milieux de culture PC3, respectivement, et ont été traités avec de la sulfo-NHS-SS-biotine pour biotinyler les protéines de la membrane externe à la surface des sEV avant l'ajout du tampon de lyse. Les protéines de surface biotinylées ont été capturées sur des billes de streptavidine et ont été libérées par DTT. b Les protéines totales, totales moins la surface et de surface ont été digérées et identifiées par une analyse HRMS semi-quantitative sans étiquette. c La présence de ces protéines a été validée par Exo-PLA et SP-PLA.

Nous avons appliqué ce flux de travail pour étudier les SF-sEV en tant que déterminants essentiels de la fertilité masculine et des biomarqueurs potentiels du cancer. Dans cette étude, nous avons cherché à élargir nos connaissances actuelles sur les protéines de surface des SF-sEV, nous permettant ainsi d'évaluer leur rôle biologique et d'identifier et de classer les SF-sEV au niveau moléculaire à des fins de diagnostic.

Les SEV du liquide séminal humain (SF-EV) et de la lignée cellulaire du cancer de la prostate PC3 ont été purifiés selon des protocoles optimisés correspondant à chaque matrice47. La procédure impliquait une combinaison d'ultracentrifugation, de chromatographie d'exclusion stérique et de séparation par gradient de saccharose. La qualité des vésicules purifiées a été examinée par microscopie électronique à transmission (MET) à coloration négative, Western blot et analyse de suivi des nanoparticules (NTA) comme recommandé par les directives 2018 Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV)48. La coloration négative EM a révélé des SF-sEV et des PC3 sEV structurellement intacts (Fig. 2a). Une analyse Western blot a été réalisée pour démontrer la présence des marqueurs sEV CD9, CD63, CD81 et de la protéine 101 du gène de susceptibilité aux tumeurs (TSG-101), et l'absence du marqueur du réticulum endoplasmique (ER) calnexine, indiquant la pureté des échantillons sEV de contaminations protéiques (Fig. 2b). Le NTA a révélé un diamètre moyen de particules de 190 et 160 nm pour les SF-sEV (c'est-à-dire du liquide séminal) et les PC3 sEV, respectivement, avec une concentration moyenne de 1,3 × 109 particules/ml et 1,4 × 109 particules/ml, respectivement (Fig. .2c).

a EM coloré négatif des SF-sEV et des PC3 sEV. b Résultats de Western blot pour les marqueurs sEV TSG-101, CD63, CD81 et CD9. Le marqueur ER calnexine a été ciblé comme contrôle négatif. c L'analyse NTA du diamètre des particules de mode a enregistré des valeurs de 155,8 et 192,2 nm pour les SF-sEV et les PC3 sEV, respectivement. d La qualité de la purification a été évaluée par électrophorèse sur gel pour les sEV PC3 et SF-sEV Repl 2 et Repl 3. A : Fraction totale moins surface des sEV PC3 ; B : Total moins surface fraction SF-sEVs Repl 2 ; C : Total moins surface SF-sEVs fraction Repl 3 ; D : Fraction SF-sEVs de surface Repl 2 ; E : Fraction SF-sEVs de surface Repl 3 ; F : Fraction de surface PC3 sEV.

Les protéines de surface des SF-sEV et PC3 sEV intacts ont été marquées à l'aide de sulfo-NHS-SS-biotine, un réactif imperméable à la membrane réagissant avec les amines primaires30. Les fractions obtenues à partir du processus de purification étaient : (i) protéine dans le lysat de sEV total (Total) ; (ii) protéines isolées des surfaces sEV (Surface), et (iii) protéines surnageantes laissées après isolement des protéines de surface (Total moins Surface) (Figs. 1a et 2d). Les protéines de chaque fraction ont été digérées par la trypsine et analysées par HRMS (Fig. 1b). Un lysat total de cellules PC3 a été préparé et analysé comme témoin. Une liste complète des protéines identifiées dans toutes les fractions pour SF-sEV, PC3 sEV et lysat de cellules PC3 est rapportée dans les données supplémentaires 1. Pour toutes les protéines identifiées dans cette étude, le tableau des données supplémentaires 1 rapporte : 1- Ontologie génique ( GO) annotation ; 2- localisation ; 3- implication dans les processus biologiques et 4- fonction moléculaire, et nous fournissons une annotation concernant la spécificité tissulaire et les voies à l'aide de données téléchargées à partir de la base de données UniProt Knowledgebase (UniProtKB). Les protéines de surface isolées identifiées par HRMS ont été confirmées comme étant exprimées sur les surfaces sEV en utilisant Exo-PLA et SP-PLA (Fig. 1c). La qualité de la purification du sEV a été évaluée par électrophorèse sur gel (Fig. 2d). De plus, afin d'évaluer la robustesse de notre flux de travail, nous avons préparé et analysé les échantillons SF-sEV en répétitions : (voir "Méthodes", Fig. 1a–c supplémentaire et Fig. 2b–g supplémentaire). Le protocole de préparation des échantillons a démontré une faible variabilité entre les répétitions (7 à 19 %). Lors de la comparaison de répliques techniques pour les mêmes échantillons biologiques (Rep 2 et Rep 3), 1086 protéines sur un total de 1364 se sont révélées être en commun pour la surface totale moins (Fig. 1b supplémentaire) et 653 sur un total de 915 pour la surface ( Fig. 1c supplémentaire). Lorsque les répliques techniques et biologiques ont été comparées pour la surface totale moins, 41 protéines ont été trouvées en commun pour Rep 1 et Rep 2, et 64 en commun entre Rep 1 et Rep 3 (Fig. 1b supplémentaire). Pour la surface Rep 1 contre Rep 2, 46 protéines communes ont été identifiées, tandis que le nombre de protéines partagées pour Rep 1 contre Rep 3 était de 31 (Fig. 1c supplémentaire). Une corrélation élevée entre l'abondance relative des protéines dans les correspondances spectrales peptidiques normalisées (nPSM) a été trouvée entre les réplicats (r de Pearson : 0, 84 à 0, 99; Fig. 2 supplémentaire).

Après avoir fusionné les protéines identifiées dans les réplicats, l'analyse des fractions de lysat total, de surface et de surface totale moins a abouti à l'identification de 1414, 1014 et 1460 protéines, respectivement (Fig. 1 supplémentaire, Données supplémentaires 1 et Fig. 3b) . Comme le montre la figure 3, 875 protéines ont été identifiées dans tous les échantillons, 381 protéines étaient en commun entre le lysat total et la surface totale moins, et 20 et 39 protéines étaient en commun entre la surface et la surface totale moins et le lysat total, respectivement.

a Les protéines identifiées par analyse MS des SF-sEV et des PC3 sEV ont été comparées aux bases de données ExoCarta et GO. b Représentation en diagramme de Venn des protéines identifiées dans les trois fractions SF-sEVs. c Représentation sous forme de diagramme circulaire des catégories de composants cellulaires de Gene Ontology (GO-CC) pour les protéines enrichies en surface totale moins. d Catégories GO-CC pour les protéines enrichies en fractions de surface. e Les dix principaux termes obtenus par analyse d'annotation fonctionnelle dans DAVID pour les protéines enrichies en fractions de surface totales moins. f Les dix principaux termes identifiés dans DAVID pour les protéines enrichies en fractions de surface. Seules les protéines identifiées dans au moins deux échantillons ont été incluses dans l'analyse.

Afin d'effectuer une analyse protéomique semi-quantitative sur toutes les fractions de liquide séminal et de PC3 sEV, le nombre de correspondances spectrales peptidiques (PSM) associées à chaque protéine identifiée a été normalisé en fonction du nombre total de PSM identifiés dans chaque échantillon pour obtenir le nPSM . Parmi les cinquante protéines les plus abondantes identifiées dans la fraction de surface des SF-sEV figuraient la séménogéline-1 (SEMG1), la séménogéline-2 (SEMG2), la fibronectine (FN1), le CD13, le CD10, la synthase des acides gras (FASN) et la créatine kinase B ( CKB). SEMG1 et SEMG2 étaient particulièrement abondants avec des valeurs nPSM de 8, 1 et 5, respectivement (tableau 1 et données supplémentaires 1). Notre analyse a abouti à l'identification de 273 nouvelles protéines sEVs putatives, actuellement non répertoriées comme protéines sEV dans la base de données Exocarta ni dans UniProtKB (Fig. 3a). L'identification des protéines de surface au moyen d'un marquage protéique à l'aide de sulfo-NHS-SS-biotine sur des sEV intacts n'assure pas une efficacité de 100 % dans l'extraction des protéines de surface, et un certain degré de contamination entre les fractions pourrait être attendu. Par conséquent, afin d'identifier les protéines les plus enrichies dans chaque fraction, un classement de changement de pli et des statistiques de test t ont été utilisés. Les protéines trouvées uniquement ou plus abondamment dans la fraction de surface par rapport à celles de la fraction de surface totale moins (changement de facteur (FC)> 2 et / ou valeur P <0, 05) ont été définies comme étant enrichies en surface. Les protéines enrichies dans la fraction de surface totale moins par rapport à celles de la fraction de surface ont été définies comme étant enrichies en cargaison. L'analyse a abouti à l'identification de 74 protéines SF-sEV enrichies en surface, dont 43 ont été classées comme protéines membranaires selon la classification des composants cellulaires GO (Données supplémentaires 1 et 2).

Les fonctions et le réseau de 74 protéines enrichies en surface ont été analysés à l'aide de STRING, un outil de recherche et une base de données biologiques pour la détection de gènes/protéines et pour la prédiction des interactions protéine-protéine (https://string-db.org/). Les protéines ont été analysées sur la base de sept critères : (1) expression dans le cytosol, (2) implication présumée dans le développement de la maladie, (3) rôles dans le système immunitaire, (4) toute fonction présumée dans le système reproducteur masculin, (5) présence de protéines dans les véhicules électriques, (6) vésicules séminales et (7) corps multivésiculaire. De brèves descriptions fonctionnelles de ces protéines sont répertoriées dans les données supplémentaires 3 et le respect d'un ou plusieurs critères pour chaque protéine est illustré dans la figure supplémentaire 3.

Les protéines les plus enrichies dans la fraction de surface par rapport à la surface totale moins étaient KRT2, DNAJC3 et CASP14 (Fig. 4a, b, données supplémentaires 2 ; trois répétitions). Les marqueurs sEV connus parmi les protéines les plus abondantes dans la fraction de surface des SF-sEV étaient ANPEP, FASN et CLU (Fig. 4c).

a Les protéines identifiées dans la surface et dans les fractions de surface totales moins ont été comparées par changement de pli et analyse statistique du test t. a Le bar plot représente le rapport des 25 protéines les plus enrichies en surface et en fractions totales moins la surface. b Le diagramme du volcan représente les changements de pli et la valeur P pour les protéines identifiées au moins dans deux échantillons. c Abondance dans les correspondances de spectre peptidique normalisé (nPSM) de marqueurs sEV connus dans la fraction de surface des SF-sEV.

De plus, nous avons analysé la localisation subcellulaire, la fonction moléculaire et les termes GO du processus biologique pour les protéines que nous avons trouvées enrichies en surface ou en cargaison (Données supplémentaires 1). Pour les SF-sEV et les PC3 sEV, l'analyse de la localisation subcellulaire a montré un fort enrichissement en protéines annotées comme étant extracellulaires parmi les protéines qui étaient plus abondantes dans la fraction de surface. Les protéines associées à la région extracellulaire représentaient 3% de la fraction de cargaison, tandis que jusqu'à 13% des protéines de la fraction de surface étaient annotées en tant que protéines de surface (Fig. 3c, d et Fig. 4 et 5 supplémentaires). De même, l'analyse des termes GO pour les fonctions moléculaires et les processus biologiques a révélé des traits spécifiques distincts pour la surface et les protéines de cargaison (Fig. 4 supplémentaire), qui sont résumés par l'analyse d'annotation fonctionnelle réalisée à l'aide de la base de données DAVID (Fig. 3e, f ). L'analyse GO fonctionnelle a révélé que les termes hautement enrichis pour la fraction de surface étaient la liaison au calcium et le filament intermédiaire, tandis que le cytoplasme et l'acétylation étaient les principaux termes pour les protéines enrichies en cargaison. Les dix principaux termes biologiques obtenus par DAVID pour chaque catégorie GO sont répertoriés dans la Fig. 4 supplémentaire.

La présence des protéines identifiées par MS à la surface des SF-sEV et PC3 sEV intacts a été étudiée plus en détail en développant des tests spécifiques Exo-PLA ou SP-PLA. Exo-PLA visualise les sEV à l'aide de plusieurs paires de sondes d'anticorps. Lorsque les deux membres d'une paire de sondes se lient étroitement l'un à l'autre à la surface des sEV, un brin d'ADN circulaire peut être physiquement généré, ce qui donne naissance à un produit RCA. Les séquences répétées du produit RCA sont ensuite visualisées à l'aide de sondes d'hybridation, marquées avec des colorants fluorescents et détectées par cytométrie en flux. Cet outil puissant permet la différenciation moléculaire des sous-populations de sEV uniquement basée sur la combinaison de protéines exprimées à leur surface45. La stratégie de déclenchement est expliquée dans la Fig. 6a supplémentaire. Nous avons utilisé une combinaison de sondes Exo-PLA ciblant des marqueurs sEV connus et hautement exprimés comme témoins et des cibles sélectionnées identifiées par notre analyse HRMS pour confirmer la présence de SEMG1, de la phosphatase acide prostatique (ACPP), de l'antigène spécifique de la prostate (PSA), de la prostate- antigène membranaire spécifique (PSMA), prostaglandine D2 (PTGDS), CD59, protéine d'ancrage A-kinase (AKAP4), protéine sécrétoire riche en cystéine 1 (CRISP1) et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase spécifique aux testicules (GAPDS) sur la surface des SF-sEV et des PC3 sEV (Fig. 5a). En particulier, nous avons identifié deux sous-populations distinctes de SF-sEV exprimant SEMG1 soit avec CD59, soit avec PSMA, tandis que pour les sEV PC3, l'expression de SEMG1 et CD59 était moins abondante. Une combinaison de sondes Exo-PLA dirigées contre SEMG1, PSMA et PTGDS a révélé des populations doublement et triplement positives pour les SF-sEV et les PC3 sEV. Une combinaison de conjugués d'anticorps dirigés contre SEMG1, GAPDS et AKAP4 a identifié des populations doubles et triples positives sur les SF-sEV mais pas sur les PC3 sEV (Fig. 5a), confirmant les données MS, où l'abondance la plus élevée d'AKAP4 a été trouvée. dans la fraction avec les protéines de surface de SF-sEV par rapport à celle des sEV PC3. Des populations doublement positives de SEMG1 et ACPP et SEMG1 et CRISP1 ont également été trouvées dans les SF-sEV et les PC3 sEV ; cependant, les populations triplement positives dans les SF-sEV semblent être beaucoup moins abondantes par rapport à la population positive pour SEMG1 avec PSMA et PTGDS ou SEMG1 avec AKAP4 et GAPDS. Comme contrôle supplémentaire pour les différents signaux fluorescents, les échantillons ont également été examinés par microscopie à fluorescence pour la visualisation des produits RCA fluorescents et la validation finale (Fig. 6b supplémentaire).

a Combinaison de différents marqueurs à la surface des sEV détectés par Exo-PLA. Le déclenchement des signaux positifs en cytométrie en flux et différentes populations sont affichés. b Les SF-sEV ont été capturés par des billes recouvertes d'anticorps pour des cibles spécifiques identifiées par des analyses HRMS (CRISP1, AKAP4, GAPDS, SMG1 et PTGDS), indiquées pour chaque panel, et détectées avec des sondes PLA contre les marqueurs CD9 et CD26. Le marqueur abondant CD68 a été utilisé comme anticorps de capture pour le contrôle positif des performances du test, le marqueur ER calnexine a été utilisé comme anticorps de capture de contrôle négatif. Les abscisses affichent la concentration des échantillons en ng de protéines totales par ml. Les axes y affichent les différences entre le cycle de seuil pour la lecture PCR en temps réel des réactions SP-PLA pour les échantillons et le cycle de seuil du contrôle négatif (tampon d'essai sans échantillons). Les barres d'erreur représentent l'écart type (SD), chaque échantillon a été exécuté en triple exemplaire.

Le SP-PLA basé sur l'immunoaffinité offre la possibilité de détecter et de quantifier les sEV intacts en ciblant jusqu'à trois protéines de surface. Dans ce cadre expérimental, les SF-sEV ont d'abord été capturés à l'aide d'anticorps dirigés contre l'une des protéines ciblées CRISP1, SEMG1, PTGDS, AKAP4 ou GAPS. Les SF-sEV capturés ont ensuite été détectés à l'aide d'une paire de sondes d'anticorps conjuguées à un oligonucléotide dirigées contre les marqueurs connus CD9 et CD26. Des signaux de détection plus élevés ont été enregistrés lorsque les SF-sEV ont été capturés par des anticorps dirigés contre les anticorps CRISP1, SEMG1 ou PTGDS par rapport aux SF-sEV capturés par des anticorps contre AKAP4 et GAPDS. Néanmoins, toutes les cibles étaient solidement détectables à la surface des SF-sEV (Fig. 5b). Comme prévu, une expérience de contrôle négatif, utilisant un anticorps de capture ciblant le marqueur ER calnexine, a donné des signaux indétectables même à des concentrations d'échantillon élevées (Fig. 5b). Les données SP-PLA étaient conformes à celles obtenues par Exo-PLA, soutenant davantage l'expression de surface des protéines identifiées dans les analyses HRMS.

Les informations sur l'identité des protéines exprimées sur la membrane des sEV peuvent être utiles pour les procédures de diagnostic et de préparation. Dans cette étude, nous avons développé une stratégie de pointe pour étudier les protéines de surface des sEV, en combinant un profilage impartial à l'aide de HRMS avec Exo-PLA45 et SP-PLA49 pour valider la présence des protéines identifiées à la surface des sEV intacts. . L'utilisation d'une approche MS impartiale nous a permis d'identifier au total 1730 protéines dans les SF-sEV et les PC3 sEV, dont 273 n'avaient pas été signalées auparavant, fournissant ainsi une liste de cibles potentielles pour de futures études sur les SF-sEV circulants et d'autres sEV. (Fig. 3a).

La stratégie décrite ici fournit un moyen efficace pour étudier les protéines de surface cellulaire ainsi que les protéines de surface EVs29. Cette approche a permis d'identifier un total de 1014 protéines de surface putatives sur les SF-sEV, où 457 protéines ont été trouvées dans les trois échantillons répliqués et 730 dans au moins deux réplicats (Fig. 1 supplémentaire). Sur les 1014 protéines, nos données ont identifié 74 protéines uniques qui ont été trouvées uniquement enrichies à la surface des sEV par rapport aux fractions totales de protéines de surface moins (Données supplémentaires 1 et 2). Les protéines identifiées dans plus d'un échantillon répété préparé pour chaque fraction représentent les découvertes les plus robustes et raisonnablement aussi les protéines les plus abondantes dans cette fraction. Cependant, nous avons toujours inclus les étapes de validation basées sur le PLA pour trois protéines trouvées dans trois échantillons répliqués (SEMGI, PTGDS et CRISP1), pour une trouvée dans deux réplicats (AKAP4) et pour une trouvée dans un seul réplicat (GAPDS ).

Les SEV libérés par un tissu ou un type cellulaire donné représentent une population hétérogène de VE50. En fait, il a été rapporté que les SF-EV séminales provenaient de plusieurs types de cellules différents dans le système reproducteur masculin51,52, contribuant peut-être à l'expression de protéines hétérogènes ainsi qu'à des fonctions hétérogènes. Une analyse protéomique globale des données a révélé que 74 protéines de surface étaient enrichies en protéines extracellulaires de SF-sEV (Données supplémentaires 2 et Fig. 3), ce qui était cohérent avec les observations précédentes de Webber et ses collègues53. En utilisant un réseau SOMAscan pour la mesure des protéines, les auteurs ont démontré que des protéines considérées comme sécrétées par la prostate pourraient, en fait, être présentes à la surface des véhicules électriques. Nos données, qui se sont concentrées sur l'évaluation des protéines de surface des sEV, renforcent donc l'hypothèse selon laquelle certaines des protéines mesurées dans les biofluides peuvent également ou uniquement être exposées à la surface des sEV.

Étant donné que l'expression des gènes et la synthèse des protéines dans les spermatozoïdes sont interrompues avant la fin de la spermatogenèse, il a été rapporté que les spermatozoïdes acquièrent une partie des molécules nécessaires à leurs fonctions complètes à partir des SF-EV, dont il a été démontré qu'ils transfèrent les protéines essentielles par fusion avec le membrane plasmique54. La capacitation des spermatozoïdes est un processus où la signalisation Ca2+ est essentielle. Comme l'ont émis l'hypothèse de Park et al., les spermatozoïdes peuvent également utiliser d'autres mécanismes, qui n'impliquent pas de canaux ioniques pour la signalisation Ca2+55. De tels mécanismes peuvent dépendre de la fusion de la membrane des spermatozoïdes avec les SF-EV, qui transportent les récepteurs et les enzymes nécessaires à la mobilisation du Ca2+. Il a déjà été démontré que le transfert de CD38 du SF-EV dans le sperme peut déclencher la libération de Ca2+ intracellulaire à partir du récepteur de la ryanodine (53). En accord avec l'hypothèse de Park, nos données suggèrent que les protéines facilitant la liaison des ions calcium sont parmi les protéines les plus enrichies dans la fraction de surface des SF-sEV (Fig. 3f et Fig. 4 supplémentaire). Cinq protéines sur les 74 trouvées particulièrement enrichies à la surface des SF-sEV, CRTAC1, AGRN, GAS6, NUCB2, NUCB1 et FLG2, sont annotées sur GO en tant que protéines de liaison au calcium (Données supplémentaires 1).

L'identification d'un grand nombre de protéines dans les SF-sEV, qui sont également connues pour être exprimées dans le système nerveux central (Données supplémentaires 1) (telles que l'isoforme 5C de la chaîne lourde de la kinésine (KIF5C), la protéine membranaire de la vésicule synaptique VAT-1 , 14-3-3 protéine thêta (YWHAQ), séquence amplifiée du carcinome du sein 1, facteur d'élongation 1-alpha 1 (EEF1A1) et protéine soluble dans l'acide cérébral 1 (BASP1)), ou la présence de protéines fortement exprimées dans le l'épithélium prostatique neuroendocrinien (antigène des cellules souches de la prostate (PSCA)) soutient l'origine neuroendocrinienne précédemment suggérée des SF-EV et leur effet potentiel connu en tant que neurotransmetteurs56,57. Cependant, des protéines telles que le récepteur CatSper55, la chromogranine B et le neuropeptide Y56 n'ont pas été identifiées dans cette étude.

Un sous-ensemble des protéines de surface identifiées par HRMS a été sélectionné pour validation à l'aide de méthodes basées sur des anticorps capables de détecter des sEV intacts via des protéines de surface exposées à l'extérieur. Le PLA représente un test moléculaire unique et puissant offrant la capacité de détecter des combinaisons de protéines en les co-localisant à proximité à l'aide de deux sondes ou plus constituées d'anticorps conjugués à des oligonucléotides d'ADN. Une telle liaison de sonde à proximité peut générer des matrices d'ADN pour une amplification par PCR ou RCA et une amplification de signal pour une détection/confirmation visuelle. L'un des formats PLA, 4PLA, a été appliqué avec succès pour démontrer des niveaux élevés de SF-sEV dans le plasma de patients atteints d'un cancer de la prostate23. Par conséquent, la combinaison des méthodes Exo-PLA et SP-PLA fournit des informations complémentaires et une opportunité unique pour l'identification des protéines de surface qui peuvent être ciblées par des tests de diagnostic. Alors que le SP-PLA permet l'identification de sEV purifiés à partir de sous-populations de sEV par identification/validation de la composition de surface des protéines, le test Exo-PLA offre une sensibilité pour la quantification des sEV à partir de biofluides.

En utilisant Exo-PLA, nous avons confirmé la présence de SEMG1, ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, CRISP1 et GAPDS à la surface des SF-sEV et PC3 sEV. Le PSA, l'ACPP et le PSMA sont bien connus pour leur rôle dans la physiologie de la prostate et comme biomarqueurs du cancer de la prostate. La présence de PSA à la surface des SF-EV a déjà été rapportée58, alors que l'ACPP et le PSMA, identifiés dans cette étude, sont des protéines membranaires intégrales59, et que le PSMA n'a été identifié que dans la membrane des lysosomes60. On en sait moins sur SEMG1, AKAP4, CRISP1, GAPDS et PTGDS, qui n'ont pas, à notre connaissance, été précédemment signalés comme étant localisés à la surface des SF-sEV ou de tout autre sEV.

Les SEMG1 et 2 sont connus pour être des composants majeurs du coagulum de sperme humain et du plasma séminal (20 à 40 % de la teneur en protéines)61,62. Les analyses d'expression des protéines ont révélé que SEMG1 est principalement exprimé dans l'épithélium glandulaire des vésicules séminales et certaines études ont démontré leur expression dans les cellules cancéreuses de la prostate63,64. Yang et ses collègues ont déjà démontré que ces protéines font partie intégrante des SF-EV25. SEMG 1 a été trouvé en complexe avec le CD52 ancré au glycosylphosphatidylinositol (GPI) et soluble, et il a été émis l'hypothèse que le CD52 ancré au GPI sert de quai à SEMG1 pour ancrer les spermatozoïdes pour former des caillots65, plus tard dégradé par le PSA en permettre la motilité des spermatozoïdes. Des études récentes ont trouvé une corrélation négative entre la motilité des spermatozoïdes et la proportion de spermatozoïdes liés aux SEMG66,67. Ces résultats suggèrent que le sperme non lié peut être un paramètre pertinent pour la fécondation in vivo68.

Bien que GAPDS, AKAP4 et PTGDS n'aient jamais été connus pour être exprimés à la surface des SF-EV, ils ont tous été identifiés comme des protéines associées à la surface des spermatozoïdes69,70, toutes deux impliquées dans la motilité des spermatozoïdes71,72 et la fécondation des ovules des mammifères73 . Il est donc plausible que SEMG1 et d'autres protéines identifiées dans notre étude puissent effectivement être transférées des cellules prostatiques et épididymaires à la surface des spermatozoïdes afin de contribuer à activer et/ou à améliorer leur fonction physiologique.

L'approche pour isoler les protéines de surface après le marquage à la biotine peut avoir certaines limites. Premièrement, l'efficacité du marquage à la biotine, un processus qui repose sur la disponibilité des amines primaires, peut varier d'une protéine à l'autre. Deuxièmement, une purification à l'aide de billes recouvertes de streptavidine peut être partielle ou incomplète, mais avec une représentation uniforme, avec un risque de liaison non spécifique aux billes74,75,76. Cela pourrait, par exemple, être la raison pour laquelle les marqueurs généraux sEV/SF-sEV, tels que PSMA1, CD9 et CD151, ont été détectés dans toutes les fractions analysées (Surface, Total moins Surface et Total lysat), mais ont été enrichis dans les fractions de surface (Fig. 4 et données supplémentaires 1). Troisièmement, les protéines de surface identifiées peuvent inclure certaines protéines de la couche absorbante, appelées corona protéiques, présentes dans les fluides corporels ou les milieux de culture, qui se lient à la surface des véhicules électriques, où elles peuvent remplir une fonction spécifique ou devenir une source de contaminations protéiques lors de l'étude. protéines membranaires77,78.

En développant ce test, nous démontrons la faisabilité de mesurer les protéines de surface et particulièrement celles des SF-sEVs, qui peuvent constituer des cibles potentielles pour le développement de nouveaux tests diagnostiques et la détection du cancer de la prostate23. Nos analyses peuvent servir de base au développement d'outils de diagnostic pour l'évaluation de la fertilité masculine en fournissant un crible moléculaire qui étudie les mécanismes nécessaires pour que les spermatozoïdes deviennent pleinement fonctionnels79. Notre enquête sur les protéines de surface SF-sEVs décrites ici, présente une preuve de concept pour un flux de travail, combinant la puissance de l'analyse protéomique MS impartiale avec des PLA ciblés pour l'identification des protéines SF-sEVs mais avec une application potentielle à tout type de VE. SP-PLA offre la possibilité unique de quantifier les véhicules électriques avec une sensibilité et une spécificité élevées, tandis que l'Exo-PLA, avec une analyse individuelle des véhicules électriques et multiparamétriques, a le potentiel de devenir une plate-forme optimale pour soutenir une enquête approfondie sur le rôle des putatifs. protéines de surface à travers les patients et les conditions pathologiques. Ces deux tests ont le potentiel d'être directement transférables pour des applications cliniques.

Le plasma séminal a été prélevé au centre de reproduction de l'hôpital universitaire d'Uppsala selon les routines existantes et avec l'autorisation du comité de révision interne8. Les deux échantillons anonymisés de SF-sEV (échantillons 1 et 2) analysés dans cette étude ont chacun été obtenus en regroupant des échantillons de plasma séminal de 5 individus. Le prélèvement d'échantillons a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université d'Uppsala (Ups 01-367) et un consentement éclairé a été obtenu. Les SF-sEV ont été purifiés à l'aide d'un protocole optimisé pour l'isolement des sEV à partir des fluides séminaux80. Le plasma séminal humain a été centrifugé à 3 000 × g pendant 10 min, puis à 10 000 × g pendant 30 min à 4 ° C pour sédimenter les débris. Ceci a été suivi d'une ultracentrifugation du surnageant à 100 000 × g pendant 2 h à 4 °C. Le culot contenant l'EV a été remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et purifié davantage par chromatographie d'exclusion de taille sur une colonne XK16/70 remplie de gel Superdex 200 (GE Healthcare). Cela a été suivi d'une séparation par gradient de densité, où les SF-sEV ont été récupérés dans la plage de densité de 1, 13 à 1, 19 g / ml. La concentration des SF-sEV purifiés a été ajustée à 2 mg / ml à l'aide du test de protéine Pierce BCA (ThermoFischer Scientific) et maintenue à -80 ° C jusqu'à utilisation.

La lignée cellulaire humaine de cancer de la prostate PC3 (ATCC-CRL1435) a été cultivée dans du milieu RPMI 1640, additionné de 2 mM de L-Glu, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Gibco, ThermoFisher Scientific, États-Unis). Les cellules ont été cultivées à 70–80% de confluence, le milieu a ensuite été remplacé par un milieu contenant 10% de FBS appauvri en EV (System Bioscience, Palo Alto, CA, USA) et les cellules ont été cultivées pendant 48 h supplémentaires. Les cellules ont été retirées et les milieux conditionnés ont été collectés par centrifugation à 300 × g pendant 10 min. Le milieu conditionné a été passé à travers des filtres de 0,22 µm (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, États-Unis) pour éliminer les débris cellulaires, suivi d'une ultra-centrifugation (Beckman Coulter) à 112 000 × g pendant 120 min dans un rotor de type SW-28 pour granuler les sEV. . Le surnageant a été soigneusement retiré et le culot a été remis en suspension dans 1 ml de PBS 1X glacé, additionné d'un inhibiteur de protéase 1X (Complete Mini®, Roche, Bâle, Suisse). Les sEV ont ensuite été chargés sur une colonne de chromatographie et séparés en utilisant la même procédure décrite pour les SF-sEV45. Les fractions contenant des sEV ont été regroupées et ultracentrifugées deux fois à 112 000 × g pendant 120 min à l'aide d'un rotor de type SW-28. Le culot de sEV résultant a été remis en suspension dans 200 µl de PBS additionné d'inhibiteurs de protéase et stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation.

Les sEV purifiés ont été décongelés et remis en suspension dans du paraformaldéhyde (PFA) à 2 %. Cinq µl des échantillons ont été déposés sur des grilles recouvertes de Formvar/carbone pendant 20 min. Les grilles ont été lavées 3 × 1 min avec du PBS 1X, puis incubées avec 1% de glutaraldéhyde pendant 5 min, suivies d'une étape de lavage de 8 × 1 min avec de l'eau distillée. Les échantillons ont été colorés dans une goutte de solution d'uranyle-oxalate (pH 7,0) pendant 5 min, puis incubés avec 4 % d'acétate d'uranyle (pH 4,0) et 2 % de méthylcellulose pendant 10 min sur de la glace, à l'abri de la lumière. L'excès d'acétate d'uranyle et de méthylcellulose a été éliminé par buvardage sur papier filtre. Les grilles ont été séchées pendant 5 à 10 min à l'air et examinées par TEM, FEI Tecnai ™ G2 (ThermoFisher Scientific, USA), fonctionnant à 80 kV.

L'analyse de suivi des nanoparticules a été réalisée à l'aide d'un système Nano sight LM10HSB équipé pour une capture vidéo rapide et un suivi des particules afin de déterminer les distributions de taille des vésicules. Chaque échantillon a été dilué 500 fois et analysé en 5 passages à chaque fois pendant 30 s, enregistré avec une vitesse de seringue de 50 en utilisant le niveau de caméra 10, le seuil de détection 8 et la taille de particule minimale attendue automatique et la distance de saut automatique dans le logiciel d'analyse version NTA Forfait 3.0.

Des volumes de 500 µl de SF-sEV et de PC3 sEV, à une concentration de 2 mg/ml, ont été lavés deux fois avec du PBS et ultracentrifugés à 112 000 × g, pendant 120 min. Le culot a été remis en suspension dans du PBS 1 × additionné d'inhibiteurs de protéase et ultracentrifugé à 112 000 × g pendant 120 minutes supplémentaires. Les culots ont ensuite été remis en suspension et incubés dans 500 µl de PBS 1 × (pH 8, 0) additionné d'inhibiteurs de protéase et de 1 mM EZ-Link sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce, Rockford, IL, USA) pendant 30 min sur glace. La biotine n'ayant pas réagi a été désactivée en ajoutant du Tris-HCl à une concentration finale de 50 mM et incubée pendant 15 min. Afin d'éliminer la biotine libre, les SF-sEV et PC3 sEV biotinylés ont été dilués dans du PBS et ultracentrifugés à 112 000 × g pendant 120 min. Les culots ont ensuite été remis en suspension dans du tampon de lyse (urée 6 M, inhibiteurs de protéases, 1% de n-octyl-β-D-glucopyranoside (β-OG) dans du PBS) et incubés pendant 1 h sur de la glace. Pour améliorer la solubilisation des protéines, les échantillons ont été vortexés toutes les 5 min pendant 5 s pendant le temps d'incubation puis soniqués pendant 30 min. Les lysats ont été centrifugés à 10 000 × g à 4 ° C pendant 10 min pour éliminer les débris. Une fraction des lysats a été stockée (lysat total), tandis que le reste a été dilué 10 fois dans du PBS 1× additionné d'inhibiteurs de protéase, divisé en trois tubes (chaque tube contient 300 μg de sEVs lysés totaux) et incubé avec 5 mg de streptavidine billes magnétiques (à la concentration de 10 mg/ml ; Dynabeads MyOne™, Invitrogen) à température ambiante (RT) avec mélange de bout en bout pendant 60 min. Des billes de streptavidine contenant des protéines de surface biotinylées ont ensuite été collectées à l'aide d'un aimant et lavées trois fois avec du PBS 1 × contenant des inhibiteurs de protéase, tandis que le surnageant contenant les protéines non biotinylées (surface totale moins) était stocké à -20 ° C. Les protéines ont été éluées des billes par une incubation de 60 min à température ambiante dans du DTT 50 mM dans du PBS, avec un mélange de bout en bout. Les protéines éluées (surface) ont ensuite été séparées des billes à l'aide d'un aimant et stockées à -20 ° C. Les concentrations totales de protéines pour tous les échantillons ont été déterminées par Dot-it-Spot-it (Maplestone, Knivsta, Suède) conformément aux instructions du fabricant. Avant de procéder au HRMS, les qualités des échantillons ont été vérifiées par électrophorèse sur gel. Les échantillons ont été dilués dans un tampon d'échantillon 4 × LDS (Invitrogen), chargés sur un gel Bis-Tris 4–12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et exécutés à 200 V pendant 50 min. Le gel a été coloré par coloration à l'argent (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) en suivant les instructions du fabricant.

Les SF-sEV, les PC3 sEV et les cellules PC3 ont été lysés dans un tampon RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) additionné d'inhibiteurs de protéase, séparés par SDS-PAGE dans des conditions réductrices et transférés avec le système de transfert à sec iBlot2 (ThermoFisher Scientific) . Le tampon de blocage LI-COR TBS (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) a été utilisé pour le blocage et l'incubation des anticorps. Les protéines ont été analysées en utilisant 1,3 µg/ml d'anticorps anti-TSG101, 0,5 µg/ml d'anticorps anti-CD9, 0,5 µg/ml d'anticorps anti-CD81, 0,5 µg/ml d'anticorps anti-CD63 et 0,1 µg/ml d'anticorps anti-calnexine, qui ont été détectés en utilisant 50 ng/ml d'IgG anti-souris d'âne IRDye 680LT ou 75 ng/ml d'IgG IRDye anti-lapin d'âne 800CW comme anticorps secondaires et analysés à l'aide du scanner Odyssey de LI-COR. Toutes les informations sur les anticorps sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

Les protéines dans la solution ont été réduites, alkylées et digérées sur filtre par la trypsine. Les peptides séchés ont été dissous dans de l'acide formique à 0,1 % et dilués avant l'injection pour charger une quantité égale de peptides pour chaque échantillon. Les peptides ont été séparés en phase inverse sur une colonne nanoLC C18, en appliquant un gradient de 90 min et électropulvérisés en ligne sur un spectromètre de masse HRMS QE-Orbitrap (Thermo Finnigan). La spectrométrie de masse en tandem a été réalisée en appliquant une dissociation collisionnelle à plus haute énergie (HCD). La recherche de données a été effectuée à l'aide de l'algorithme Sequest, intégré dans Proteome Discoverer 1.4 (ThermoFisher Scientific) par rapport à une base de données FASTA Uniprot (Homo sapiens, révisé, publié en mai 2019, 20421 entrées). Les paramètres de recherche ont été définis sur Taxonomie : Homo sapiens ; Enzyme : Trypsine. La modification fixe était le carbamidométhyle (C), tandis que les modifications variables étaient l'oxydation (M) et la désamidée (NQ). Les critères de recherche pour l'identification des protéines ont été définis sur au moins deux peptides correspondants et un niveau de confiance de 95 % par protéine.

Exo-PLA a été réalisée en adaptant le protocole publié par Löf et al.45. En bref, un mélange d'anticorps de capture monoclonaux de souris anti-CD9, CD63 et dipeptidyl peptidase-4 (CD26) (tableau supplémentaire 1), a été immobilisé via des oligonucléotides d'ADN conjugués à des oligonucléotides immobilisés sur des billes magnétiques comme décrit précédemment. Une liste d'oligonucléotides est fournie dans le tableau supplémentaire 246. Un mélange des trois anticorps a été utilisé afin de maximiser l'efficacité de la capture de sEV. Un certain nombre de sondes PLA - des anticorps conjugués à des oligonucléotides - ont été utilisées pour analyser la composition en protéines de surface des sEV capturés. Exo-PLA donne lieu à un signal lorsque des paires de sondes PLA à proximité génèrent des cercles d'ADN qui modèlent la formation de produits RCA, qui peuvent être visualisés avec des oligonucléotides marqués par un fluorophore. Ici, une sonde PLA représentait un mélange d'anticorps dirigés contre deux marqueurs de surface exosomiques bien connus, la néprilysine (CD10) et l'aminopeptidase N (CD13), en couplant le même oligonucléotide d'ADN aux deux anticorps. Une deuxième sonde PLA a été préparée en couplant l'oligonucléotide d'ADN homologue séparément à des anticorps dirigés contre les cibles spécifiques de sEV suivantes pour identifier les sous-populations de sEV : ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, SEMG1, GAPDS, CRISP1 et CD59 (Données supplémentaires 1) . Les sEV marqués avec les différents produits RCA ont été analysés par cytométrie en flux sur les instruments BD FACS Aria III ou BD LSR Fortessa (BD biosciences). Des portes pour les signaux positifs dans différentes populations ont été définies à l'aide de contrôles négatifs contenant tous les réactifs expérimentaux à l'exception des cibles (SF-sEV ou PC3 sEV). La stratégie de déclenchement est expliquée dans la Fig. 6a supplémentaire. Pour chaque réaction, 1 µl de sEV marqués aux produits RCA ont été échantillonnés pour contrôle par microscopie à fluorescence. Les images ont été acquises avec un objectif Plan-Apochromat 40 ×, NA 1,3, sur un microscope Zeiss Axio Imager Z2 et un appareil photo numérique Hamamatsu C11440.

La SP-PLA a été réalisée comme décrit précédemment49,81 avec quelques modifications. En bref, 25 à 35 µg d'anticorps dirigés contre les protéines suivantes ont été couplés à 5 mg de billes magnétiques Dynabeads M-270 Epoxy conformément aux instructions du fabricant (Cat. No. 14301, ThermoFisher Scientific) : Calnexin, TSG101, PTGDS, AKAP4, CD63, SEMG1 et CRISP1 (tableau supplémentaire 1). Les deux sondes SP-PLA pour la détection des sEV cibles ont été construites en couplant les oligonucléotides conjugués à la streptavidine SLC1 et SLC2 (tableau supplémentaire 2) à des anticorps biotinylés contre CD26 et CD9, respectivement, dans un rapport de 1: 1. Les SF-sEV et les PC3 sEV ont été dilués dans le tampon de dosage (1 mM D-biotine, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween-20, 100 nM IgG de chèvre, 100 µg/ml d'ADN de sperme de saumon, 5 mM EDTA dans 1x PBS) dans une dilution en série de 10 fois, 100 µg/ml–100 pg/ml pour les SF-sEV et 70 µg/ml–70 pg/ml pour les PC3 sEV. Une série de dilutions de 10 fois de 20 µg/ml à 20 pg/ml a été appliquée lors du ciblage de CD63 dans les SF-sEV. Tous les échantillons ont été analysés en triple, capturés sur 200 ng/µl de billes couplées à un anticorps et marqués avec 500 pM de chaque sonde SP-PLA dans un volume de réaction de 50 µl de tampon de dosage. La PCR en temps réel a été réalisée dans des volumes de 25 µl de tampon d'amplification (tampon PCR 1×, MgCl2 2,5 mM, Sybr Green 0,25×, amorce BioFwd 0,1 μM, amorce BioRev 0,1 μM, BioSplint 0,1 μM, ATP 0,08 mM, dNTP 0,2 mM ( avec dUTP), 0,03 U/μl Platinum Taq ADN polymérase, 0,01 U/μl T4 ligase et 0,002 U/μl Uracil-DNA glycosylase) sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 (Applied Biosystems) programmé à 95 °C pendant 10 min , suivi de 45 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min.

Dans cette étude, un total de deux échantillons anonymisés de SF-sEV ont été analysés, chacun a été préparé en regroupant des échantillons de plasma séminal de cinq individus. Les valeurs de correspondance du spectre peptidique (PSM) ont été utilisées pour l'analyse qualitative et semi-quantitative. Cependant, les valeurs ont été transformées en normalisant au nPSM total. Les valeurs manquantes ont été traitées comme manquantes non aléatoires (MNAR)82 et remplacées par la valeur de 0,05 (approche d'imputation à valeur unique). Le degré d'enrichissement en protéines de surface a été calculé comme le rapport de nPSM entre la surface et le total moins les fractions de surface. Une valeur moyenne a été calculée lorsque des répliques étaient disponibles. Les répliques 1 et 2 des lysats totaux de SF-sEV (Figs. 1a et 2a supplémentaires) représentaient à la fois des répliques biologiques et techniques (Rep1, de l'échantillon 1 et Rep2, de l'échantillon 2), tandis que les trois répliques pour la surface et la surface totale moins inclus un réplicat biologique et deux réplicats techniques : Rep 1, SF-sEVs purifiés à partir de l'échantillon 1 : Rep 2 et Rep 3 : SF-sEVs purifiés à partir de l'échantillon 2. La signification du ratio calculé a été évaluée par le test t. La variabilité entre les répétitions a été calculée comme [(nombre de protéines identifiées de manière unique pour chaque échantillon/nombre total de protéines) × 100]. L'analyse et la représentation des données ont été réalisées à l'aide de l'environnement R pour le calcul statistique et la visualisation et du logiciel GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc.). Les protéines identifiées ont été comparées à la base de données Exocarta. Le fichier d'annotation des protéines répertorié dans les données supplémentaires 1 a été téléchargé à partir d'Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/). La base de données d'annotation, de visualisation et de découverte intégrée Bioinformatics Resources 6.8, NIAID/NIH et le système de classification PANTHER83 ont été utilisés pour l'annotation Gene Ontology (GO) des protéines enrichies dans les différentes fractions (ratio ≥2, nombre de répliques ≥2 ). Les données Exo-PLA ont été analysées avec le logiciel BD FACS Diva 8.0 (BD biosciences). Pour SP-PLA, tous les échantillons ont été analysés en triple et les données ont été analysées avec le logiciel Microsoft Excel. La figure 1a a été générée manuellement à l'aide du logiciel Inkscape.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE84 avec l'identifiant de jeu de données PXD037791. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 3, 4 et Figs supplémentaires. 1, 2, 4, 5 sont fournies dans les données supplémentaires 1. Les données sources sous-jacentes à la Fig. 3 supplémentaire sont fournies dans les données supplémentaires 2. Des images Western blot non recadrées et non éditées sont disponibles dans la Fig. 7 supplémentaire.

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Nous sommes reconnaissants aux installations de protéomique et BioVis basées sur la spectrométrie de masse de l'Université d'Uppsala pour leur aide et au Dr Ahmed Ibrahim pour son aide avec le NTA. Ce travail a été soutenu par le SciLifeLab, Conseil suédois de la recherche sous les subventions 2020-02258, 2017-04152, 2018-02943, 2018-06156, 2018-02806 et 2015-4870, Torsten Söderbergs Stiftelse sous la subvention M130/16, Swedish Prostate Cancer Federation, Exodiab, The Swedish Cancer Foundation, The Cancer Research Foundations of Radiumhemmet and the Swedish Foundation for Strategic Research under Grant SB16-0046. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans aucune partie de cette étude.

Financement en libre accès fourni par l'Université d'Uppsala.

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini.

Département d'immunologie, de génétique et de pathologie, Science for Life Laboratory, Université d'Uppsala, Uppsala, Suède

Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini, Radiosa Gallini, Liza Löf, Qiujin Shen, Ryoyo Ikebuchi, Alireza Azimi, Ulf Landegren & Masood Kamali-Moghaddam

JSPS Overseas Research Fellow, Japan Society for the Promotion of Science, Tokyo, Japon

Ryoyo Ikebuchi

Département des sciences médicales, Chimie clinique, Université d'Uppsala, Uppsala, Suède

Louise Dubois et Anders Larsson

Centre de découverte et d'innovation, Hackensack Meridian Health, Nutley, NJ, États-Unis

Olivier Loudig

Division d'immunologie et d'allergie, Département de médecine, Karolinska Institutet, Solna, Suède

Suzanne Gabrielsson

Département de chimie-BMC, Chimie analytique, Université d'Uppsala, Uppsala, Suède

Jonas Bergquist

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MKM, EMD, UL, CF et JB ont conçu l'idée et planifié l'étude. EMD, AA, QS, AL, OL et LD ont participé à la production et à la purification des véhicules électriques. EMD et CF ont mené des expériences d'enrichissement en protéines. RG a planifié et réalisé des expériences de Western blot et SP-PLA et l'analyse des données. JB était responsable de l'analyse MS. CF a planifié et réalisé l'analyse des données de MS. EMD et SG ont aidé NTA. EMD, RI et LL ont effectué des expériences de microscopie électronique et d'Exo-PLA et analysé des données avec l'aide de l'AACF, EMD, RG et LL ont rédigé l'article sous la supervision de MKM. Tous les auteurs ont contribué à la version finale du manuscrit.

Correspondance à Masood Kamali-Moghaddam.

Ulf Landegren est actionnaire de Navinci et Olink Proteomics, détenant les droits sur la technologie PLA. D'autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Éditeur principal de la manipulation : Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Manouchehri Doulabi, E., Fredolini, C., Gallini, R. et al. Profilage des protéines de surface des vésicules extracellulaires dérivées de la prostate par spectrométrie de masse et tests de proximité. Commun Biol 5, 1402 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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Reçu : 25 mai 2021

Accepté : 08 décembre 2022

Publié: 22 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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